吳雪丹， 丁寶月， 傅應(yīng)華*

(1.浙江省象山縣第一人民醫(yī)院，浙江象山 315700;2.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興 314001)

復(fù)方苦參洗劑處方由苦參、黃柏、蛇床子、百部、黃芩等十五味中藥組成，具有清熱解毒、燥濕止瘙功效，用于改善婦女帶下過多，外陰瘙癢等癥狀。原藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(試行)［1］鑒別項(xiàng)下規(guī)定了黃柏、黃芩的薄層色譜鑒別，定量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定了蛇床子素含有量測(cè)定，規(guī)定每1 mL含蛇床子素不得少于8 μg。黃柏有效成分之一為鹽酸小檗堿［2］，黃芩有效成分之一為黃芩苷［2］，兩者均具有抗菌消炎作用，需要定量控制。有關(guān)鹽酸小檗堿和黃芩苷的定量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法等［3-14］。為提高中藥復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了摸索，建立了HPLC法梯度洗脫同時(shí)測(cè)定復(fù)方苦參洗劑中鹽酸小檗堿和黃芩苷。

1 儀器與材料

美國(guó)Dionex高效液相色譜儀由P680四元低壓梯度泵，UVD170U紫外-可見檢測(cè)器，ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器，Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站組成;BP211D電子天平(精度±0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);USC502型超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110713-200609，純度98.1%)，黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110715-200815，純度95.2%)，復(fù)方苦參洗劑樣品9批(規(guī)格:100 mL相當(dāng)于含生藥黃柏、黃芩各1 g)，批號(hào)分別為 20110302，20110303，20110315，20110413，20110411，20110419，20110422，20110425，20110501(浙江中法制藥有限公司提供 )。乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL中含辛烷磺酸鈉0.1g)(20∶80)，維持0～3 min;在 3～17 min流動(dòng)相比例線性改變至(40∶60)， 17～25 min; 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣量20 μL;柱溫30℃。在此色譜條件下，鹽酸小檗堿和黃芩苷之間以及與其它相鄰雜質(zhì)峰的分離度均符合要求(R＞1.5)，理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取對(duì)照品黃芩苷9.46 mg、鹽酸小檗堿1.66 mg，用甲醇定容10 mL量瓶，分別制成0.946 mg/mL和0.166 mg/mL的貯備液。再精密量取適量，用甲醇稀釋至黃芩苷36.02 mg/mL，鹽酸小檗堿6.51 mg/mL，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取復(fù)方苦參洗劑5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇 15 mL，超聲(功率160 W，工作頻率56 kHz)處理10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。

2.3 陰性對(duì)照液的制備 按處方比例稱取除黃柏、黃芩以外的其余藥材，按照復(fù)方苦參洗劑制備工藝制備缺黃芩、黃柏的雙空陰性樣品。按照2.2.2項(xiàng)下方法操作，制成缺黃芩、黃柏的陰性對(duì)照液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照液，進(jìn)樣分析。結(jié)果陰性對(duì)照液在鹽酸小檗堿峰和黃芩苷峰位置上沒有峰出現(xiàn)，對(duì)供試品測(cè)定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 取0.166 mg/mL、0.946 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液用甲醇稀釋至鹽酸小檗堿3.3、6.5、9.8、13.0、16.3、24.4 μg/mL，黃 芩 苷18.0、36.0、54.0、72.0、90.1、135.1 μg/mL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:鹽酸小檗堿Y=0.876 5X+0.089 6，r=0.999 8;黃芩苷Y=0.998 3X+0.490 2，r=0.999 8。表明鹽酸小檗堿在 3.3 ～24.4 μg/mL，黃芩苷在 18.0 ～135.1 μg/mL 。

圖1 對(duì)照品(A)、復(fù)方苦參洗劑(B)和缺黃柏、黃芩陰性對(duì)照(C)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A)，sample(B)and negative sample without Phellodendri chinensis Cortex and Scutellariae Radix(C)

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液(鹽酸小檗堿 6.51 μg/mL，黃芩苷 36.02 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣 6次，結(jié)果鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.09%、0.93%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20110413)，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算鹽酸小檗堿和黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.50%、1.81%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20110413)的供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、6、8，16 h 進(jìn)樣分析，計(jì)算鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.37%、1.28%。表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取復(fù)方苦參洗劑陰性對(duì)照樣品5 mL，共6份，各精密加入鹽酸小檗堿0.116 mg/mL及黃芩苷1.106 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液1 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算鹽酸小檗堿及黃芩苷的回收率，結(jié)果見表1、表2。

表1 鹽酸小檗堿回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Recovery results of berberine hydrochloride in sample(n=6)

表2 黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Recovery results of baicalin in sample(n=6)

2.10 樣品測(cè)定 取9批樣品，制備供試液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)法峰面積計(jì)算鹽酸小檗堿及黃芩苷的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 樣品中鹽酸小檗堿和黃芩苷測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination of baicalin and berberine hydrochloride in lotions samples(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以甲醇為溶劑，分別測(cè)定了鹽酸小檗堿和黃芩苷的紫外光譜圖，鹽酸小檗堿最大吸收波長(zhǎng)為266 nm，黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)為275 nm。兩者在波長(zhǎng)280 nm處有等吸收點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，鹽酸小檗堿和黃芩苷均有較，， 。

3.2 溶劑的選擇 復(fù)方苦參洗劑為經(jīng)水煎煮制成的中藥制劑，水溶性雜質(zhì)較多，在進(jìn)樣前需經(jīng)純化處理。采用甲醇作溶劑，沉淀物較松，易于過濾;而采用乙醇作溶劑，沉淀物呈黏稠狀，不易過濾，故選擇甲醇作溶劑。

3.3 提取時(shí)間的選擇 取樣品分別超聲處理5、10、15、20 min，制備供試液，測(cè)定鹽酸小檗堿和黃芩苷，結(jié)果超聲處理10、15、20 min含有量無差異，故確定超聲處理為10 min。

3.4 溶劑用量的選擇 取樣品5 mL，分別加入甲醇10、15、20 mL，制備供試品液，測(cè)定鹽酸小檗堿和黃芩苷，結(jié)果溶劑用量10、15、20 mL含有量無差異，確定甲醇用量為15 mL。

3.5 流動(dòng)相系統(tǒng)的優(yōu)化 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)作流動(dòng)相，乙腈比例為50%時(shí)，黃芩苷保留時(shí)間為2.7 min，鹽酸小檗堿23 min未出峰;在0.1%磷酸中加入0.1%辛烷磺酸鈉，保持乙腈比例不變，黃芩苷保留時(shí)間不變，鹽酸小檗堿保留時(shí)間為4.4 min，而降低乙腈比例，黃芩苷、鹽酸小檗堿保留時(shí)間均延長(zhǎng)?？紤]到復(fù)方制劑成分復(fù)雜，采用梯度洗脫更能調(diào)整好黃芩苷、鹽酸小檗堿兩組分出峰時(shí)間，經(jīng)反復(fù)修改有機(jī)相比例，優(yōu)化各組分的分離度，達(dá)到黃芩苷、鹽酸小檗堿與相鄰組分峰分離度均符合規(guī)定，確定的梯度洗脫程序具有重復(fù)性好、柱效高、出峰速度快等優(yōu)點(diǎn)。另對(duì)磷酸與辛烷磺酸鈉的濃度進(jìn)行考察，結(jié)果表明，在分離度滿足要求的前提下，盡量減少磷酸和辛烷磺酸鈉的質(zhì)量濃度，以0.1%磷酸和0.1%辛烷磺酸鈉為宜。同時(shí)，試驗(yàn)也表明，色譜柱選用25 cm長(zhǎng)柱較好，可增加各組分的保留值，有利于各組分的分離。

3.6 含量限度的擬定 從表3中9批樣品的測(cè)定結(jié)果看，黃芩苷、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度差異較大，黃芩苷質(zhì)量濃度范圍在0.016 1～0.039 1 mg/mL之間;鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度范圍在0.158 9～0.256 6 mg/mL之間。為了使產(chǎn)品質(zhì)量可控，提高療效，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)增加黃芩苷、鹽酸小檗堿定量測(cè)定項(xiàng)目，考慮到不同產(chǎn)地黃芩、黃柏中黃芩苷、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度的差異，擬定樣品中黃芩苷、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度應(yīng)不低于0.20 mg/mL和0.020 mg/mL。

［1］WS-5412(B-0412)-2002.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)［S］.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:286，282.

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