金英華， 何正有， 王艷峰， 安 靜， 姚 潔， 李 維， 鄒 昆

(中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都610052)

銀杏達(dá)莫注射液是由銀杏葉提取物及雙嘧達(dá)莫制備而成的復(fù)方制劑。該制劑具有改善心腦血管循環(huán)、減少血栓及動(dòng)脈硬化、降低血液黏度等作用，臨床上主要用于預(yù)防和治療冠心病、血栓栓塞性疾?。?-2］。銀杏達(dá)莫注射劑的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了黃酮苷和雙嘧達(dá)莫的含有量［2］，對萜類內(nèi)酯沒有要求。鑒于萜類內(nèi)酯是銀杏葉相關(guān)制劑的重要有效成分，對免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、缺血性損傷有保護(hù)作用［3-4］，因此有必要對銀杏達(dá)莫注射液中的萜類內(nèi)酯進(jìn)行定量測定。銀杏達(dá)莫注射液主要生產(chǎn)企業(yè)有:貴州益佰制藥股份有限公司、博安兄弟制藥有限公司、湖北民康制藥有限公司、山西普德藥業(yè)股份有限公司等。本試驗(yàn)選擇了3個(gè)廠家生產(chǎn)的9批樣品，采用HPLC-ELSD法測定萜類內(nèi)酯。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent高效液相色譜儀(型號Agilent 1200)、Altech蒸發(fā)光散射檢測器(型號 Altech 2000ES)。

1.2 對照品、試劑和供試藥品 白果內(nèi)酯(批號100865-200605)、銀 杏 內(nèi) 酯 A(批 號 100862-200608)、銀杏內(nèi)酯B(批號100863-200508)、銀杏內(nèi)酯C(批號100864-200906)，均購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純)、異丙醇(色譜純)、水(去離子水)。供試藥品:貴州益佰制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號:20101208、20100309、20100501，規(guī)格:5 mL/支;博安兄弟制藥有限公司，產(chǎn)品批號:20100301、20100403、20101102，規(guī)格:10 mL/支;湖北民康制藥有限公司，產(chǎn)品批號:101029、100923、101020。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Welch C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-異丙醇-水(9 ∶7.5 ∶83.5);體積流量1.0 mL/min;漂移管溫度105℃，載氣體積流量3.0 L/min。理論板數(shù)按白果內(nèi)酯計(jì)算不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品制備 取銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯，精密稱量，加甲醇制成每1 mL含銀杏內(nèi)酯A 0.5 mg，銀杏內(nèi)酯B、C和白果內(nèi)酯各0.2 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品制備 精密吸取注射液30 mL，用2%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，用乙酸乙酯萃取4次(30、20、20、20 mL)，合并乙酸乙酯，用5%乙酸鈉溶液20 mL洗滌，分取乙酸鈉溶液，用10 mL乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，以20 mL水洗滌，有機(jī)相濃縮至干，殘?jiān)蛹状嫁D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，并以甲醇定容至刻度，搖勻、濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品供試液制備 按處方配制不添加銀杏提取物的陰性樣品，精密吸取30 mL，照2.3項(xiàng)下供試品制備方法同法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取混合對照品、供試品溶液和陰性樣品供試液注入液相色譜儀進(jìn)行分析并記錄色譜圖。以白果內(nèi)酯峰計(jì)算其理論板數(shù)為22 708;白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C 4成分間分離度均大于1.5;陰性樣品供試液譜圖中在上述組分的峰位處均無干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果表明4種成分可同時(shí)進(jìn)行定量分析。

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)和陰性對照品(C)色圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance(A)，sample(B)and negative sample(C)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品4、6、8、10、15 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣測定并記錄色譜圖。按照外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程，分別以白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C對照品的質(zhì)量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯A在1.98 ～7.44 μg、銀杏內(nèi)酯 B 在 0.84 ～3.15 μg、銀杏內(nèi)酯C在0.82～3.07 μg、白果內(nèi)酯在0.80～3.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:銀杏內(nèi)酯 A:Y=1.086 8X+5.844 2，r=0.999 3;銀杏內(nèi)酯B:Y=0.957 9X+5.347 9，r=0.999 3;銀杏內(nèi)酯 C:Y=0.939 1X+5.335 5，r=0.999 1;白果內(nèi)酯:Y=1.096 1X+5.863 8，r= 0. 999 6。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯峰面積的 RSD值分別為0.79%、0.84%、0.77%、0.51%，表明本法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液室溫放置，分別于0、2、4、6、8、24 h 精密吸取 10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯峰面積的 RSD分別為 1.37%、1.44%、1.32%、1.11%，表明本供試品溶液室溫24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品，按2.2.2項(xiàng)下分別制備6份供試液，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計(jì)算供試品中白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C的含有量。測得其含有量的RSD 值分別為1. 07%、1. 06%、1. 50%、1.11%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取銀杏達(dá)莫注射液(貴州益佰制藥有限公司，含有量已知)15 mL，共6份，兩份精密加入混合對照品溶液1 mL(含銀杏內(nèi)酯A 0.80 mg，銀杏內(nèi)酯B 0.25 mg，銀杏內(nèi)酯C 0.51 mg，白果內(nèi)酯0.26 mg);兩份精密加入混合對照品1 mL(含銀杏內(nèi)酯A 1.05 mg，銀杏內(nèi)酯B 0.29 mg，銀杏內(nèi)酯C 0.62 mg，白果內(nèi)酯0.31 mg);兩份精密加入混合對照品1 mL(含銀杏內(nèi)酯A 1.20 mg，銀杏內(nèi)酯B 0.35 mg，銀杏內(nèi)酯 C 0.75 mg，白果內(nèi)酯0.39 mg)。按2.2.2項(xiàng)下分別制備6份供試液，測定，計(jì)算，求得白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C的平均回收率和RSD值，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)Tab.1 Results of recovery tests

2.5 樣品測定結(jié)果 取銀杏達(dá)莫注射液樣品，每個(gè)批號的樣品按2.2.2項(xiàng)下分別制備3份供試液，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計(jì)算供試品中白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C的質(zhì)量濃度。9批銀杏達(dá)莫注射液樣品測定結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 目前對銀杏葉制劑中銀杏萜類內(nèi)酯的測定有較多報(bào)道，涉及的劑型包括片劑［5-7］、滴丸劑［8］、注射劑［9-12］等。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的測定方法使用甲醇-四氫呋喃-水體系或乙腈-四氫呋喃-水體系為流動(dòng)相。采用甲醇-異丙醇-水體系，以異丙醇代替四氫呋喃，降低了流動(dòng)相對人體的毒性和試驗(yàn)成本。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)廠家生產(chǎn)的銀杏達(dá)莫注射液均含有萜類內(nèi)酯，但質(zhì)量濃度略有差異，貴州益佰制藥股份有限公司和博安兄弟制藥有限公司的產(chǎn)品萜類內(nèi)酯質(zhì)量濃度均在0.60～0.80 mg/mL范圍內(nèi)，且不同批次間差異較小，湖北民康制藥有限公司的產(chǎn)品不同批次間萜類內(nèi)酯質(zhì)量濃度差異稍大。

3.3 萜類內(nèi)酯是銀杏葉提取物重要的有效成分之一，本試驗(yàn)選取的3個(gè)廠家生產(chǎn)的9批樣品中全部含有萜類內(nèi)酯，表明現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定黃酮苷含有量和雙嘧達(dá)莫含有量無法全面反應(yīng)藥品的質(zhì)量，建議增加對萜類內(nèi)酯含有量的規(guī)定，更全面的反應(yīng)藥品質(zhì)量。

表2 銀杏達(dá)莫注射液內(nèi)酯測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination in injection samples

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