劉春明，王強(qiáng)，楊帆，胡楊

（長(zhǎng)春師范學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130032）

車前草是車前科車前屬（Plantago）車前Plantago asiaticalL的干燥全草[1]。車前草多酚從車前草中提取的天然植物多酚類活性化合物，這類化合物含有酚羥基基團(tuán)，具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基的能力、延緩衰老的能力，是一類極具開發(fā)價(jià)值的天然產(chǎn)物[2-4]。因此，尋找一種高效、實(shí)用的提取、純化工藝是進(jìn)一步開發(fā)車前草多酚的主要環(huán)節(jié)。

大孔樹脂是一種有機(jī)高分子聚合物，具有比表面積大、吸附容量大、選擇性好、再生處理方便等諸多優(yōu)點(diǎn)[5]，近年來(lái)，在植物中多酚化合物的純化應(yīng)用越來(lái)越多，如茶多酚[6]、蘋果多酚[7]、葡萄多酚[8]等。本文采用大孔樹脂對(duì)車前草多酚進(jìn)行了分離純化。以期建立大孔樹脂分離純化車前草多酚的分離純化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

車前草采于吉林市左家，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)鄧名魯教授鑒定為車前科植物車前Plantago asiatica L.車前科植物車前的干燥全草。

1.2 儀器與試劑

DU800紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)BECKMAN COULTER公司；ALPHA2-4 LSC真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；3K30臺(tái)式冷凍離心機(jī)、沒食子酸：德國(guó)Sigma公司；大孔樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 車前草多酚提取液的制備

準(zhǔn)確稱取車前草粗粉500 g，加入70%乙醇回流提取3次，每次4 000 mL，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，殘?jiān)铀芙庵? 000 mL（0.5 g藥材/mL），離心，備用。

1.2.2 車前草多酚含量測(cè)定方法

1.2.2.1 酒石酸亞鐵溶液的配制

準(zhǔn)確稱取FeSO4·7H2O 1 g，酒石酸鉀鈉5 g，加蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至1 000 mL，避光保存。

1.2.2.2 pH為7.5的磷酸緩沖液的配制

準(zhǔn)確稱取 Na2HPO4·12H2O 60.2 g，NaH2PO4·2H2O 5 g，加蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，加蒸餾水定容至1000 mL，冷藏。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品500 mg，用蒸餾水溶解定容至50 mL。吸取5 mL，用蒸餾水稀釋至10 mL容量瓶，得到5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取 80、120、160、200、240、280 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液置于 25 mL 容量瓶中，加蒸餾水4 mL，酒石酸鐵溶液5 mL，搖勻，再加入pH為7.5的磷酸緩沖溶液稀釋至刻度，用蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入同樣試劑作空白，于540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。以濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為濃度c和吸光度值A(chǔ)的關(guān)系：A=15.335c-0.054 9，r=0.999 8，在 0.016 mg/mL～0.056 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.4 樣品含量的測(cè)定

從樣品溶液中量取1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法于540 nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出濃度值即可。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理

取大孔樹脂加乙醇浸泡至充分溶脹，用乙醇洗滌至加蒸餾水無(wú)渾濁，再用蒸餾水洗滌至無(wú)醇味，備用。

1.2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

量取濕樹脂10 mL置于250 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL車前草多酚提取液，置于振蕩器中，25℃，120 r/min振蕩2 h，放置過(guò)夜，充分吸附后，從上清液中取樣，測(cè)定多酚含量。根據(jù)公式計(jì)算樹脂靜態(tài)吸附量：

吸附量（mg/mL）=（C0-C）V/G

式中：C0、C 為吸附前后車前多酚的含量，（mg/mL）；V為供試液體積，mL；G為樹脂量取量，mL。

1.2.5 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

將10 mL充分吸附的樹脂過(guò)濾，用水沖洗后濾干，置于具塞錐形瓶中，加入95%的乙醇水溶液50 mL，密封置于振蕩器中，25℃，120 r/min振蕩，解吸一定時(shí)間后，從上清液中取樣，測(cè)定多酚含量。根據(jù)公式計(jì)算靜態(tài)解吸率：

解析率（%）=C×V×100/W

式中：C為洗脫液多酚濃度，（mg/mL）；V為洗脫液總體積，mL；W為吸附總量，mg。結(jié)果表明靜態(tài)解吸率為71.60%。

1.2.6 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

樹脂濕法裝柱（內(nèi)徑1.2×30 cm），柱高11.5 cm，以1 mL/min的流速加入車前多酚含量為3.972 mg/mL的供試液20 mL，吸附飽和后，樹脂柱用蒸餾水洗滌至用苯酚硫酸法檢測(cè)至無(wú)糖，以去除樹脂吸附的糖和水溶性雜質(zhì)，然后用洗脫液洗至無(wú)色為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)試驗(yàn)

2.1.1 樹脂種類的選擇

選用 AB-8、DA201、D101、DM301 4 種大孔樹脂對(duì)車前草多酚進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 樹脂對(duì)車前草多酚的靜態(tài)吸附量Fig.1 Amount of static adsorption of different types of resin for Plantago asiatic

由圖1可知，吸附達(dá)到平衡后，4種樹脂均可吸附多酚物質(zhì)，說(shuō)明大孔樹脂對(duì)多酚物質(zhì)的吸收具有選擇性，其中弱極性樹脂D101和AB-8對(duì)多酚的吸附能力較強(qiáng)，中極性樹脂DM301和極性樹脂DA201吸附能力較弱，為進(jìn)一步選定樹脂種類，對(duì)AB-8和D101進(jìn)行靜態(tài)解吸試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 樹脂對(duì)車前草多酚的靜態(tài)解吸曲線Fig.2 Static desorption curves of different types ofresin for Plantago Asiatic polyphenols

由圖2可知，D101樹脂在2 h內(nèi)基本達(dá)到解吸平衡，解吸率為81.6%；AB-8樹脂在2.5 h內(nèi)基本達(dá)到解吸平衡，解吸率為79.8%，多酚類物質(zhì)基本被洗脫下來(lái)。因此選用D101型樹脂對(duì)車前多酚提取物進(jìn)行純化。

2.1.2 靜態(tài)吸附時(shí)間的確定

圖3為D101樹脂靜態(tài)吸附曲線。

圖3 D101樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.3 Static adsorption curves of D101 resin

從吸附曲線上得知，吸附2 h后，車前草多酚濃度不再減少，大孔樹脂達(dá)到吸附達(dá)到平衡。因此，吸附時(shí)間選擇在2 h。

2.2 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

2.2.1 上樣速度的考察

樹脂濕法裝柱，粗提液以不同的流速上樣，使樣品動(dòng)態(tài)吸附，計(jì)算吸附量。圖4顯示了不同的上樣速度對(duì)吸附率的影響。

圖4 供試液車前多酚上樣速度對(duì)吸附效果的影響Fig.4 The influence of the content of the Plantago Asiatic polyphenols on the adsorption

上樣速度慢，有利于樹脂對(duì)多酚類化合物的吸附，流速過(guò)快，溶液中的多酚物質(zhì)會(huì)來(lái)不及吸附到樹脂的內(nèi)表面，就被沖出柱子，導(dǎo)致吸附量降低。但流速低會(huì)影響到生產(chǎn)效率，延長(zhǎng)生產(chǎn)周期。由圖4可知，在2 BV/h、3 BV/h兩種上樣速度，樹脂吸附性能相差不大，優(yōu)于4 BV/h的情況。因此，上樣速度選擇3 BV/h。

2.2.2 洗脫劑濃度的考察

樹脂濕法裝柱，將車前草粗提液裝入樹脂柱中，進(jìn)行吸附，再用蒸餾水洗滌至流出液無(wú)色。然后分別用10%、30%、50%、70%、90%乙醇進(jìn)行洗脫，分別測(cè)定洗脫液中多酚含量，繪制洗脫曲線見圖5。

圖5 乙醇濃度對(duì)解吸效果的影響Fig.5 Effect of EtOH concentration on desorption rate

選擇曲線最高點(diǎn)作為洗脫濃度，由洗脫曲線可知，選擇30%乙醇作為車前草多酚的洗脫溶劑。

2.2.3 洗脫流速的考察

樹脂濕法裝柱，車前草粗提液以3 BV/h速度上樣，吸附2 h后，先用蒸餾水洗脫至無(wú)色，再分別用乙醇溶液以不同速度洗脫，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總多酚的量，計(jì)算洗脫效率，結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫速度對(duì)解吸率的影響Fig.6 The influence of elution speed on the adsorption rate of Plantago Asiatic polyphenols

從圖6可以看出，洗脫速度為2 BV/h與4 BV/h時(shí)洗脫率較好，洗脫率相差不大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)，洗脫速度慢，時(shí)間長(zhǎng)，因此選擇4 BV/h進(jìn)行洗脫。

3 結(jié)論

在D101大孔樹脂對(duì)車前草多酚的分離純化中，當(dāng)供試液的車前草多酚含量為3.972 mg/mL，以30%乙醇作為洗脫劑，進(jìn)樣速度為3 BV/h，吸附時(shí)間為2 h，洗脫速度為4 BV/h時(shí)，車前草多酚純度由原來(lái)的3.07%提高到17.36%，純度提高了近5倍。說(shuō)明D101大孔樹脂發(fā)純化車前草多酚雖然能使其純度得到了一定的提高，但還不夠理想，若想得到純度更高的的車前草多酚還要結(jié)合其他的分離純化方法。

車前草作為藥食同源的中藥材，近幾年，其綜合利用價(jià)值逐漸引起人們的重視，除作藥用外，在保健食品中也得到廣泛的應(yīng)用，目前已開發(fā)出了一些新產(chǎn)品，如車前草可溶性膳食纖維、保健飲料等。而對(duì)車前草中具有抗氧化、抗衰老作用的多酚類成分的研究還不夠深入[6-7]。本研究對(duì)車前草多酚的開發(fā)研究具有重要意義。

：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(2005年版一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005:46-47

[2]陳衛(wèi)群,王曉春,鐘飛,等.車前草、車前籽抗氧自由基作用的比較研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2004,11(3):480-481

[3]李麗,劉志強(qiáng),劉春明,等.車前草中苯乙醇苷化合物的電噴霧多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2004,27(8):1430-1434

[4]王曉春,龍?zhí)K,徐克前,等.車前草水煎液對(duì)氧自由基清除作用的研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2002,9(2):139-140

[5]朱浩,侯世祥,孫毅毅,等.大孔吸附樹脂吸附純化不同中藥有效部位特性研究[J].,中國(guó)中藥雜志,1998,23(10):604-609

[6]陳龍勝,鐘世安,周春山,等.樹脂吸附法分離高純茶多酚新工藝研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2004,24(4):65-67

[7]王振宇,劉春平.大孔樹脂AB-8對(duì)蘋果多酚的分離純化[J].食品研究與開發(fā),2009,30(4):21-24

[8]熊何健,吳國(guó)宏.大孔吸附樹脂分離純化葡萄多酚的研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28(11):74-77

[9]張麗華,何余堂,劉巖,等.車前草蘋果汁保健飲料的加工技術(shù)研究[J].食品工業(yè),2007(6):29-30

[10]張建民,肖小年,易醒,等.車前草可溶性膳食纖維的提取及其對(duì)自由基清除能力的研究[J].天然產(chǎn)物的研究與開發(fā),2007(19):667-670