歐陽(yáng)昌漢，張瑞雪，葉濤，吳基良

（1.咸寧學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430070）

自由基系指外層軌道含有未配對(duì)的電子、原子團(tuán)或特殊狀態(tài)的分子。由于自由基可引起細(xì)胞損傷和死亡，與衰老、癡呆等某些疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系，致使抗自由基生物學(xué)與功能食品科學(xué)的研究成為一個(gè)活躍的領(lǐng)域，尋找天然抗氧化劑和自由基清除劑已越來越引起人們的關(guān)注[1]。黃酮類化合物因具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、降脂作用而成為近年來的研究熱點(diǎn)；對(duì)富含黃酮化合物的中草藥進(jìn)行篩選，將為天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

葛花為豆科植物野葛 [Pueraria Lobata（Willd.）Ohwi]的干燥花蕾，是藥食同功的保健美食，具有解酒護(hù)肝、抗腫瘤、降糖之功效，為我國(guó)民間用于解酒的傳統(tǒng)中藥，亦是目前許多解酒保健品成分之一，其主要有效成分為黃酮類化合物[2-4]。目前有關(guān)葛花中總黃酮的提取方法已有報(bào)道，但其存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗大、提取率低等缺點(diǎn)[5]。為此，將超聲技術(shù)用于葛花中總黃酮的提取，同時(shí)對(duì)黃酮提取物進(jìn)行含量測(cè)定及體外自由基清除研究，進(jìn)而為更好地開發(fā)和利用葛花中黃酮類物質(zhì)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

葛花：江西橫峰葛源綠山葛粉廠，經(jīng)我院藥用植物教研室鑒定為豆科蝶形花亞科葛屬植物野葛的干燥花蕾；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制劑鑒定所，批號(hào)：0080－9504；1，1，－二苯基苦基苯阱（DPPH）、2，2′－聯(lián)氨－雙（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）二胺鹽（ABTS）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

SB－5200超聲波清洗儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；50－Conc紫外可見分光光度儀：美國(guó)VARIAN公司；RE－5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪予華儀器廠；TDL－5臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葛花中總黃酮提取方法

精確稱取干燥葛花粉末10 g，置于500 mL燒杯中，加入適量濃度甲醇300 mL，超聲波輔助提取一段時(shí)間，提取液過濾。濾渣反復(fù)提取3次，合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至一定體積，4 000 r/min離心15 min，吸取上清液進(jìn)行脫脂、去糖、棄蛋白，即得樣品液。

1.3.2 葛花中總黃酮提取條件研究

采用正交設(shè)計(jì)方法，以甲醇為溶劑，選擇提取溫度、溶劑濃度、提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，對(duì)葛花中總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Orthogonal test level-factor table

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

準(zhǔn)確稱取5.25 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用90%乙醇配制成濃度為0.021 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，90%乙醇定容至刻度。在200 nm～400 nm波長(zhǎng)段進(jìn)行紫外掃描，于最大吸收波長(zhǎng)265 nm紫外光下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品總黃酮含量測(cè)定

吸取超聲提取后的葛花上清液1 mL，離心，取上清液0.1 mL，用90%的乙醇稀釋50倍。以90%乙醇作為空白對(duì)照，在265 nm波長(zhǎng)紫外光下，用1 cm石英比色皿測(cè)定吸光度，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)葛花樣品中總黃酮含量。

1.3.5 總抗氧化能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[6]，取已稀釋過的ABTS·+儲(chǔ)藏液1.2 mL，加入不同濃度葛花總黃酮溶液0.1 mL，反應(yīng)時(shí)間為6 min，在734 nm處測(cè)定其吸光度。

清除率SA/%=（Ao－As）/As×100。

1.3.6 DDPH清除率測(cè)定

取DPPH溶液1.5 mL，加入不同濃度的葛花總黃酮溶液1.5mL，搖勻，在25℃避光放置30min，以1.5mL 90%乙醇與1.5 mL水混合液調(diào)零，在最大吸光波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度。用1.5 mL無水乙醇代替樣品液，得到吸光度為A；用1.5 mL無水乙醇代替DPPH溶液，得到吸光度為Aj。清除率SA/%=[A0－（As－Aj）]/A0×100。

1.3.7 超氧陰離子清除率測(cè)定

取 50 mmol/L Tris－HCl緩沖液（pH=8.2）2.5 mL，加入不同濃度葛花總黃酮溶液0.4 mL，25℃水浴保溫10 min，加入5 mmol/L鄰苯三酚溶液0.1 mL，混勻后立即倒入比色杯，于特征波長(zhǎng)320 nm處每隔30 s測(cè)定鄰苯三酚溶液3 min內(nèi)吸光度變化。以吸光度對(duì)時(shí)間進(jìn)行線性回歸處理，測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率。清除率 SA/%=（As－A0）/A0×100。

1.3.8 NO清除率測(cè)定

在反應(yīng)體系中加入10 mmol/L硝普鈉0.5 mL，PBS緩沖液（pH=7.4）0.5 mL，不同濃度的樣品溶液0.5 mL，于25℃環(huán)境中放置反應(yīng)180 min，然后取反應(yīng)液1 mL，依次加入Griess反應(yīng)試劑，混勻后在25℃反應(yīng)30 min，以0.5 mL無水乙醇與1.5 mL水混合調(diào)零，在540 nm下測(cè)量吸光度。用1.5 mL無水乙醇代替樣品液，得到吸光度為A0；用1.5 mL無水乙醇代替硝普鈉溶液，得到吸光度為Aj。清除率SA/%=[A0－（As－Aj）]/Ao×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品含量測(cè)定

以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the absorption capacity of rutin

進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，得回歸方程：y=30.812x+0.001 7，R2=0.999 9，說明蘆丁在所取的濃度范圍內(nèi)其濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

從直觀分析表看出，在所選取的四個(gè)因素內(nèi)，極差大小順序是D＞C＞B＞A；D的極差最大，反映為當(dāng)D因素水平變動(dòng)時(shí)，對(duì)提取產(chǎn)率的影響最大，A因素對(duì)提取產(chǎn)率的影響最小。分析均值k可以得到各因素的較優(yōu)水平是：A2，B2，C3，D3：即使用濃度為 50%甲醇溶液，料液比為1∶30（g/mL），在70℃溫度下，超聲2.0 h為葛花提取的最佳方案，見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與極差分析結(jié)果Table 2L9（34）orthogonal experiment design and result analysis

以因素A作為誤差項(xiàng)，方差分析結(jié)果表明，因素C和因素D對(duì)提取產(chǎn)率的影響較為顯著（P＜0.05），而因素A和因素B影響不明顯（P＞0.05），這與極差分析得出的結(jié)果相一致，提示提取時(shí)間和提取溫度對(duì)葛花中黃酮提取影響較為顯著。在上述最佳提取條件下，葛花總黃酮的平均提取產(chǎn)率為17.48%。

2.3 葛花總黃酮的總抗氧化能力

ABTS·+經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色水溶性ABTS·+自由基，當(dāng)向其中加入抗氧化物質(zhì)時(shí)，則該物質(zhì)會(huì)與ABTS·+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在ABTS·+自由基的最大吸光波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度的變化，即可換算出被測(cè)物質(zhì)總的抗氧化能力。當(dāng)吸光值越低時(shí)，表示樣品對(duì)ABTS·+的清除能力越強(qiáng)，見圖2。

圖2 葛花總黃酮的總抗氧化能力Fig.2 The total antioxidant capacity of total flavonoids from Puerariae Flos

如圖2可見，葛花總黃酮的總抗氧化能力隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，表明總黃酮抗氧化能力與黃酮質(zhì)量濃度有明顯的量效關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)葛花總黃酮質(zhì)量濃度為600 μg/mL時(shí)，清除率可達(dá)83.26%。

2.4 葛花總黃酮清除DPPH作用

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種較為穩(wěn)定的自由基。當(dāng)抗自由基活性物質(zhì)與其作用時(shí)，通過與其孤對(duì)電子配對(duì)，致使其吸收峰消失或減弱。因此通過測(cè)定吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性，見圖3。

圖3 葛花總黃酮對(duì)DPPH的清除作用Fig.3 DPPH radical scavenging activity of total flavonoids from Puerariae Flos

從圖3可以看出，葛花總黃酮與VC對(duì)DPPH都有明顯的清除作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力增強(qiáng)，表明葛花總黃酮與VC對(duì)DPPH的清除能力與濃度有明顯的量效關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)葛花總黃酮質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，DPPH的清除率可達(dá)71.62%，提示葛花總黃酮對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)清除作用。

2.5 葛花總黃酮清除超氧陰離子作用

在弱堿性條件下，鄰苯三酚自身氧化分解產(chǎn)生O2-·，隨著反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，O2-·在體系中不斷積累，導(dǎo)致反應(yīng)液在320 nm處的吸光度隨時(shí)間而線性增大，因此，測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化率，并與空白液對(duì)比可得到被測(cè)物抑制O2-·積累的作用能力，見圖4。

圖4 葛花總黃酮對(duì)O2-·的清除作用Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of total flavonoids from Puerariae Flos

從圖4可以看出，葛花總黃酮對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·具有一定的清除作用，且隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加其清除率逐漸上升。在實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)葛花總黃酮質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL時(shí)，O2-·的最大清除清除率可達(dá)37.97%，提示葛花總黃酮對(duì)O2-·具有一定的清除作用。

2.6 葛花總黃酮清除NO作用

葛花總黃酮清除NO作用，見圖5。

圖5 葛花總黃酮對(duì)NO自由基的清除作用Fig.5 Nitric oxide radical scavenging activity of total flavonoids from Puerariae Flos

從圖5可以看出，葛花總黃酮對(duì)NO自由基具有一定的清除作用，并且隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加其清除率逐漸上升。在實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)葛花總黃酮質(zhì)量濃度為1200μg/mL時(shí)，NO自由基的清除率可達(dá)56.24%，提示葛花總黃酮對(duì)NO自由基具有清除作用。

3 結(jié)論

1）超聲輔助提取葛花中黃酮的最佳工藝條件為：50%甲醇溶液，料液比為 1∶30（g/mL），在 70℃溫度下，超聲2.0 h，葛花總黃酮的提取率為17.48%。

2）葛花總黃酮對(duì)DPPH、O2-·和NO自由基均具有清除作用，而且與黃酮的濃度成正相關(guān)性。當(dāng)濃度達(dá)600 μg/mL時(shí)，總抗氧化能力可達(dá)83.26%；當(dāng)黃酮濃度為400 μg/mL時(shí)，DPPH清除率可達(dá)71.62%，提示葛花總黃酮在人類保健事業(yè)上有潛在的利用價(jià)值，也為其進(jìn)一步的研究和開發(fā)利用提供理論參考。

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