蔡文倩，盧佳琨，蘭桃芳，王麗媛，孟良玉

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧錦州 121013）

蜂花粉是經(jīng)蜜蜂采集加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花粉形成的花粉球[1]。蜂花粉中含有豐富的營養(yǎng)成分如必需氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)元素、胡蘿卜素、多糖等活性物質(zhì)，因此被譽(yù)為“微型營養(yǎng)庫”[2-3]。此外，蜂花粉中多酚類和黃酮類物質(zhì)廣泛存在，它們有卓越的抗氧化作用和清除自由基能力，被認(rèn)為是有效的抗氧化劑。

蜂花粉的種類很多，一般按照植物來源分類。不同花粉之間營養(yǎng)成分和生物學(xué)功能均存在一定差別。因此，研究不同種類蜂花粉的抗氧化作用具有重要的應(yīng)用價值[4-6]。本實驗通過測定蜂花粉清除DDPH自由基（DPPH·）、清除羥基自由基（·OH）、清除超氧陰離子自由基（O2-·）、清除亞硝酸鹽的能力及還原力對五種蜂花粉進(jìn)行體外抗氧化活性的比較。為不同種類蜂花粉作為天然抗氧化劑被開發(fā)利用提供一定參考。從植物原料中提取的天然抗氧化劑，具有安全、無毒等優(yōu)點，越來越受到歡迎，天然抗氧化劑的研究也成為一個研究熱點[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五種蜂花粉（荷花、綠茶、油菜、玫瑰、茉莉）：錦州人益園養(yǎng)蜂場；二苯代苦味肼基自由基標(biāo)準(zhǔn)品、Tris均為分析純：Sigma 公司；無水乙醇、FeSO4·7H2O2、水楊酸、H2O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）、NaNO2、NaOH、Al（NO3）3、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、VC、BHT、HCl均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722N紫外可見分光光度計、FA－2004電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋：城威瑞科教儀器；SZF－06A脂肪測定儀：上海新嘉電子有限公司；TD5A－WS低速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂花粉醇提物的制備

每種蜂花粉各取5 g，以料液比1∶15（g/mL）加入90%乙醇，在80℃下提取2 h，抽濾3次后加熱揮發(fā)，直至體積為50 mL。采用NaNO2－Al（NO3）3比色法測定提取率，并計算濃度，最后將醇提物、VC、BHT 3種物質(zhì)用無水乙醇分別配置成 2、4、6、8、10 μg/mL 的溶液。

1.3.2 對DPPH自由基清除能力的測定[8]

精確吸取2 mL不同濃度樣品醇提物于試管中，分別加入2 mL 2×10－4moL/mL DPPH溶液，搖勻后置于25℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，在517 nm處測定吸光度值A(chǔ)i。同時測定2 mL不同濃度樣品提取液與2 mL無水乙醇混勻后的吸光度值A(chǔ)j和2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混勻后的吸光度值A(chǔ)0。用等質(zhì)量濃度的VC、BHT代替樣品做對照，計算清除率（E）：

1.3.3 對羥基自由基清除能力的測定[9]

精確吸取0.3 mL不同濃度樣品醇提物于試管中，依次向試管中加入2 mL 9 mmoL/L FeSO4、2 mL 9 mmoL/L水楊酸、2 mL 8.8 mmoL/L H2O2，用蒸餾水定容至10 mL并搖勻，在37℃下恒溫加熱30 min后在510 nm處測定其吸光度值A(chǔ)i；將體系中樣品用0.3 mL無水乙醇代替，在相同條件下測定其吸光度值A(chǔ)0；將體系中H2O2用蒸餾水代替在相同條件下測定其吸光度值A(chǔ)j。用等濃度的VC、BHT代替樣品做陽性對照，計算清除率（E）：

1.3.4 對亞硝酸鹽清除能力的測定[10]

精確吸取0.2 mL不同濃度樣品醇提物于25 mL容量瓶中，然后加入pH為3.0的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液5 mL、5 mg/L亞硝酸鈉溶液1.8 mL，搖勻后置于37℃恒溫水浴鍋中恒溫反應(yīng)1 h，加入2.0 mL 0.4%的對氨基苯磺酸溶液，搖勻后靜置5 min再加入0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻后靜置15min。在540nm處測定其吸光度值A(chǔ)。用等濃度的VC、BHT代替樣品做對照，根據(jù)下式計算清除率：

式中：A0為未添加提取物NaNO2的吸光度；A為添加提取物后NaNO2的吸光度。

1.3.5 還原力的測定[11]

精確吸取0.2 mL不同質(zhì)量濃度樣品醇提物于試管中，加入2.0 mL pH為6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L）及2.0 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50℃恒溫水浴鍋中加熱20 min后，向混合液中加入2.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后，待室溫下反應(yīng)10 min后，于700 nm處測定吸光度值。吸光度值越大則表示樣品還原能力越強(qiáng)，用等質(zhì)量濃度的VC、BHT代替樣品做對照。

1.3.6 對超氧陰離子自由基清除能力的測定[12]

向各容量瓶中加入3mmoL/L鄰苯三酚溶液0.3mL，再分別加2 mL不同濃度的樣品醇提物，用pH為8.3的Tris－HCl緩沖溶液定容至9 mL，迅速混勻并以蒸餾水作參比，在325 nm處每隔30秒測一次吸光度值，直到反應(yīng)啟動后的第6分鐘結(jié)束測定，把所得的數(shù)據(jù)以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸曲線，得到的直線斜率為反應(yīng)速率ΔA、ΔA0，用等濃度的VC、BHT代替樣品做對照。清除率計算公式如下：

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率；ΔA為加入樣液后鄰苯三酚自氧化法速率；單位均為吸光度每分鐘的增值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉醇提物清除DPPH自由基的能力

在相同條件下，5種蜂花粉不同濃度醇提取物對DPPH自由基的清除能力如圖1所示，其對DPPH自由基均有較好的清除效果，且在試驗濃度范圍內(nèi)隨醇提物濃度的增加而增強(qiáng)。在反應(yīng)體系中油菜花粉對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)但次于VC，在質(zhì)量濃度為4 μg/mL處，油菜花粉醇提取物的清除率與VC的清除率最接近（分別為：43.9%、44.3%）。在質(zhì)量濃度2 μg/mL～4 μg/mL之間，玫瑰花粉醇提取物的清除率先弱于綠茶花粉醇提物，后強(qiáng)于綠茶花粉醇提物的清除率?；ǚ鄞继嵛?、VC、BHT對DPPH自由基清除能力的大小順序為：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞綠茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.2 蜂花粉醇提物清除羥基自由基的能力

在對羥基自由基清除作用的研究中發(fā)現(xiàn)，5種蜂花粉醇提物對其均有較好的清除能力，且隨醇提物濃度的增加，清除率呈上升趨勢，醇提物與清除率在實驗濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)，見圖2。

5種蜂花粉中油菜蜂花粉的清除率最高。在質(zhì)量濃度2 μg/mL～6 μg/mL之間玫瑰花粉醇提物的清除率先弱于綠茶花粉醇提物，后強(qiáng)于綠茶花粉醇提物的清除率，且二者的清除率曲線在質(zhì)量濃度8 μg/mL～10 μg/mL之間的變化趨勢一致，在質(zhì)量濃度為10 μg/mL處，油菜蜂花粉和VC的清除率較接近?？偟膩碚f，五種蜂花粉醇提物、VC、BHT對羥基自由基清除能力的大小順序為：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞綠茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.3 蜂花粉醇提物清除亞硝酸鹽的能力

隨著蜂花粉醇提物濃度的增加，五種蜂花粉醇提物對亞硝酸鹽的清除率呈上升趨勢，且清除效果較好，如圖3所示。

在質(zhì)量濃度4 μg/mL～8 μg/mL之間，油菜花粉醇提物的清除率呈直線上升，且其變化趨勢與VC一致。在質(zhì)量濃度為4 μg/mL時，綠茶花粉醇提取物、玫瑰花粉醇提取物、茉莉花粉醇提取物的清除率相接近（清除率分別為：30.6%、30.3%、29.8%）。五種蜂花粉醇提物、VC、BHT對亞硝酸鹽的清除能力的大小順序為：VC＞油菜花粉＞綠茶花粉＞玫瑰花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.4 蜂花粉醇提物還原力的測定

通過對5種蜂花粉醇提物還原力測定可以看出，其醇提物均具有較強(qiáng)的還原力，且隨著質(zhì)量濃度的增大，5種蜂花粉醇提物的還原力不斷增強(qiáng)，如圖4。

油菜花粉醇提物的吸光度值在試驗濃度范圍內(nèi)的上升趨勢接近直線，其還原效果小于VC強(qiáng)于其它蜂花粉醇提物的還原能力。總的來說，5種蜂花粉醇提物、VC、BHT還原力的大小順序為：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞綠茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.5 蜂花粉醇提物清除超氧陰離子自由基的能力

超氧陰離子自由基（O2－·）的作用與生物衰老、某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，5種蜂花粉醇提取物對超氧陰離子自由基的清除能力如圖5所示。

5種蜂花粉醇提物質(zhì)量濃度與清除率在實驗范圍內(nèi)呈正相關(guān)。在5種花粉醇提液中，油菜花粉的醇提物對O2－·的清除能力最強(qiáng)僅次于VC。在質(zhì)量濃度2 μg/mL處，綠茶花粉醇提取物與茉莉花粉醇提取物清除率（清除率分別為：18.9%、19.2%）相接近，且在質(zhì)量濃度 4 μg/mL～10 μg/mL 之間時，二者的清除率曲線變化基本一致。實驗結(jié)果表明超氧陰離子自由基清除能力的大小順序為：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞綠茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

3 結(jié)論

本試驗采用醇提取法，在乙醇濃度為90%、固液比1∶15、提取時間2 h、提取溫度80℃的提取條件下提取抗氧化物質(zhì)，并測定提取率。通過對清除DPPH自由基（DPPH·）、清除羥基自由基（·OH）、清除亞硝酸鹽、還原能力、清除超氧陰離子自由基（O2－·）能力的大小進(jìn)行研究，比較5種蜂花粉醇提物的抗氧化性能，并以VC、BHT作參比對照，得到如下結(jié)論，清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基以及還原力能力的大小均為：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞綠茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉；清除亞硝酸鹽能力的大小為：VC＞油菜花粉＞綠茶花粉＞玫瑰花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。5種蜂花粉醇提物的抗氧化性如下：油菜花粉醇提物的抗氧化性最好（但小于VC）；荷花花粉醇提物抗氧化效果最差；玫瑰、茉莉、綠茶花粉醇提物三者的抗氧化效果依次降低，但都大于BHT。

油菜、綠茶、玫瑰、茉莉、荷花五種蜂花粉醇提物體外都具有一定的抗氧化性能，因此在天然抗氧化劑和功能食品的開發(fā)方面均顯示出良好的前景。

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