張軼博 曾瑞霞 牛 靜 鄭少鵬 賈弘禔 丁 衛(wèi)*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069;2.遼寧醫(yī)學(xué)院免疫與病原生物學(xué)教研室，遼寧錦州121001;3.遼寧醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，遼寧錦州121001)

可致腫瘤細胞死亡的人α乳清蛋白(human αlactalbumin made lethal to tumor cells，HAMLET)是一種以人源α乳清蛋白為主要成分、可導(dǎo)致腫瘤大量死亡的復(fù)合物。HAMLET最初在人乳抑菌效應(yīng)的研究被偶然發(fā)現(xiàn)，繼而被證實為一種對腫瘤細胞有強烈殺傷作用的效應(yīng)分子［1］。在使用不同細胞系的研究［2］中發(fā)現(xiàn)HAMLET具有選擇性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細胞、部分胚胎細胞和淋巴細胞發(fā)生凋亡的效應(yīng)，而對成熟的分化細胞沒有顯著的毒性作用。進一步的研究［3］表明HAMLET具有廣譜的抗腫瘤作用，能夠殺傷超過40種不同組織來源的腫瘤細胞系。在動物在體模型和臨床預(yù)試驗［4］中，HAMLET對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤，皮膚乳頭狀瘤［5］及膀胱癌［6］等均有較好的療效，且無明顯的不良反應(yīng)［7］。鑒于HAMLET在腫瘤治療中的潛在臨床應(yīng)用前景，當(dāng)前對HAMLET的研究開始關(guān)注其結(jié)構(gòu)特點，誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的機制以及其規(guī)?；a(chǎn)流程的優(yōu)化等方面。

HAMLET［8］或 BAMLET［9］(bovine α-lactalbumin made lethal to tumors)的基本組成為人或牛源的α乳清蛋白(human or bovine α-lactalbumin，HLA or BLA)與油酸(oleic acid，OA)按一定比例復(fù)合形成的不均一性分子。Svensson M等［8］通過體外離子交換層析方法獲得了HAMLET，并且明確了其作為人乳中的抗腫瘤活性成分。該層析制備方法可得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HAMLET復(fù)合物，其活性可在真空干燥后長期保存。但是這種方法制備過程比較繁瑣，材料和設(shè)備需求復(fù)雜，且耗時較長。此后，多個研究小組嘗試建立更簡易的HAMLET制備方法，多采用脫鈣后的apo-HLA與OA在不同的條件下進行共同孵育或直接混合。雖然這些改進的方法也能夠產(chǎn)生有活性的HAMLET或BAMLET，但是無一例外對α乳清蛋白的用量和質(zhì)量需求提出了更高的要求，同時也面臨對進一步量產(chǎn)的挑戰(zhàn)。

本課題組通過高效原核表達含His標(biāo)簽的重組人HLA蛋白，經(jīng)NTA金屬鎳螯合柱一步純化后，將EDTA除鈣離子后的apo-rHLA與油酸水溶懸液直接混合，得到了具有高活性腫瘤細胞殺傷效應(yīng)的HAMLET復(fù)合物;同時對其理化特性和生物學(xué)活性進行了較為全面的分析，并且與同類產(chǎn)物BAMLET進行了對比。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

牛α-乳清蛋白純品、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)購于 Sigma-Aldrich公司;8-苯胺基萘-1-磺酸(8-anilinonaphtalene-1-sulfonic acid，ANS)購自上海生工公司;鎳離子親和層析柱料購自GE公司;BCA蛋白質(zhì)定量分析試劑盒購于Novagen公司;碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、DeadEndTMFluorometric TUNEL System、MTS試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品;鼠抗人His標(biāo)簽抗體購于碧云天公司;IRDye800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于LICOR公司;DAPI細胞核染料購于中杉金橋公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript?RT reagent Kit購自大連TaKaRa公司;Trizol等其余試劑為分析純產(chǎn)品，購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司);Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences公司);Spectra Max M2多功能分光光度儀(Molecular Devices公司);DM 5000B熒光顯微鏡以及Leica DMIRB倒置熒光顯微成像系統(tǒng)，(Leica公司)。

1.3 人α乳清蛋白的pET30a(+)原核表達載體的構(gòu)建

MCF-7乳腺癌細胞的總RNA由經(jīng)典的Trizol法提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得MCF-7細胞的cDNA文庫。通過PCR擴增編碼人α乳清蛋白成熟肽鏈的核酸序列，引物的設(shè)計序列為 F:5'-GGGAATTCcatatgAAGCAATTCACAAAATGTGAGCTG-3';R:5'-CCGctcgag-CAACTTCTCACAAAGCCACTGTTCC-3'，小寫序列為酶切位點。擴增片段純化后經(jīng)NdeⅠ和XhoⅡ雙酶切連接入pET30a(+)質(zhì)粒，完成帶His融合C端標(biāo)簽的人α乳清蛋白原核表達載體的構(gòu)建，經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測序分析證實其序列完全正確。

1.4 重組人α乳清蛋白的表達和純化

用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，經(jīng)IPTG(0.5 g/L)在37℃誘導(dǎo)2 h后，離心收集細菌，并重懸于PBS中。超聲裂菌后，高速離心分別得到上清和沉淀。以Gu-MCAC變性緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，6 mol/L guanidine hydrochloride，pH 8.0)溶解富含目的蛋白的沉淀，通過逐滴加入復(fù)性緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1.6 mol/L guanidine hydrochloride，5 mmol/L reduced glutathione，0.5 mmol/L oxidized glutathione，pH 8.0)并混勻至500 mL，得到可溶性的復(fù)性蛋白。復(fù)性蛋白加載至鎳離子親和層析柱，用梯度咪唑緩沖液洗脫，分段收集蛋白樣品。定性和定量分析后，將含目的蛋白的洗脫液合并，以ddH2O透析，濃縮后真空冷凍干燥，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)15%SDS-PAGE蛋白凝膠電泳和考馬斯藍染色分別對有/無IPTG誘導(dǎo)菌在裂解前/后的不同組分，以及不同純化階段的蛋白產(chǎn)物進行檢測，確定目的蛋白分布及純度。

1.5 重組人α乳清蛋白和油酸復(fù)合物(rHAMLET)的制備與結(jié)構(gòu)指標(biāo)分析

重組HLA或BLA溶于1 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0溶液中，4℃過夜以去除Ca2+。經(jīng)蛋白超濾管濃縮至2 mg/mL，制成Apo-HLA溶液。在此溶液中逐滴加入OA儲存液(210 mmol/L)，并不斷渦旋至HLA和OA的摩爾比為1∶15，然后在60℃加熱10 min，冷卻至室溫后離心去除多余OA。溶液經(jīng)0.22 μm的濾器過濾后為HAMLET，分裝保存于-80℃。HAMLET使用前解凍，在60℃預(yù)熱10 min。

將100 μL 0.2 g/L rHLA，rHAMLET，BAMLET和0.088 g/L OA的0.9%NaCl溶液，分別加入96孔板中，于37℃孵育1 h后，用分光光度計在250～300 nm的紫外譜段下讀取掃描A值，并且繪制曲線。

將100 μL濃度為0.1 g/L上述不同樣品與超過50倍摩爾濃度的疏水染料ANS混合，在37℃避光結(jié)合反應(yīng)1 h，與蛋白結(jié)合后的ANS可在365 nm下被熒光激發(fā)，其在400～600 nm區(qū)間的發(fā)射光譜由Spectra Max M2分光光度計記錄，并且通過Soft Max 5.2軟件處理繪制光譜曲線。

1.6 細胞培養(yǎng)與形態(tài)觀察

人乳腺癌MCF-7細胞系，人宮頸癌HeLa細胞系為本實驗室凍存，并常規(guī)傳代。MCF-7細胞和HeLa細胞在5%CO2，37℃條件下，于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞用于接種和后續(xù)實驗。

HeLa細胞接種2×104個/孔于12孔培養(yǎng)板(預(yù)先加入包被處理的圓形蓋玻片)，經(jīng)5%CO2，37℃過夜培養(yǎng)至細胞貼壁。更換無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，加入終濃度為1 g/L BLA，rHLA，0.2 g/L BAMLET，rHAMLET或0.088 g/L OA，1 h后補充加入FBS至終濃度10%，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。在倒置熒光顯微鏡下觀察各處理組的細胞形態(tài)變化并采集數(shù)字圖像。小心將細胞以PBS清洗2次，然后以4%多聚甲醛固定20 min，用PBS重復(fù)漂洗2次。用含有DAPI染料的封片劑將鋪有細胞的蓋玻片安置于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細胞及細胞核的形態(tài)并采集圖像。

1.7 細胞活力試驗

HeLa細胞經(jīng)胰酶消化后，以105個/孔接種于96孔板中，經(jīng)5%CO2，37℃過夜培養(yǎng)至細胞貼壁。更換無血清的DMEM培養(yǎng)基孵育30 min后，分別將前述不同的處理或?qū)φ赵噭┘尤敫鹘M樣品并混勻。1 h后加入FBS至終濃度為10%。繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，加入MTS試劑，于37℃孵育4 h后，溶解并稀釋樣本，在波長490 nm下檢測光度吸收值(A490)。

1.8 Western blotting分析

超聲裂解菌液中原核表達蛋白通過BCA實驗進行蛋白定量后，將等量的蛋白由15%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上。經(jīng)1.5%BSA室溫封閉1 h后，將濾膜與鼠抗His標(biāo)簽的一抗4℃孵育過夜，然后與IRDye800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG熒光二抗室溫孵育1 h。充分漂洗后，經(jīng)Odyssey成像系統(tǒng)掃描800 nm紅外熒光圖像并進行分析處理。

1.9 細胞凋亡實驗

HeLa細胞接種2×104個/孔于12孔培養(yǎng)板，過夜5%CO2，37℃培養(yǎng)至細胞貼壁。換無血清的DMEM培養(yǎng)30 min，分別加入0.1，0.4 g/L rHAMLET和0.2 g/L BAMLET，1 h后添加FBS至終濃度10%，繼續(xù)孵育6 h。以4%多聚甲醛固定細胞后，用propidium iodide進行預(yù)染色，然后采用Dead EndTMFluorometric TUNEL System試劑盒對處理后的HeLa細胞進行染色，檢測細胞的凋亡，具體步驟參照供應(yīng)商推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程。

2 結(jié)果

2.1 pET30a-HLA-6×His原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

HLA是一種結(jié)合鈣離子球形蛋白(圖1A)，其種屬間的同源物高度保守，并且多種屬的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析。鑒于HLA在人乳腺細胞中高表達，我們從構(gòu)建的MCF-7細胞cDNA文庫中，針對HLA成熟肽編碼序列設(shè)計引物，利用PCR擴增HLA編碼片段，用以構(gòu)建了pET30a-HLA-6×His原核表達載體(圖1B)。所得到的PCR特異性擴增產(chǎn)物大小為392 bp(圖1C)。利用限制性核酸內(nèi)切酶(Nde I和Xhol I)雙酶切及T4連接酶反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物克隆到pET30a(+)多克隆插入位點，轉(zhuǎn)化宿主細菌后得到的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定(圖1D)和上海生工公司測序分析，插入序列與GenBank中HLA的cDNA編碼序列完全一致。

圖1 人α-乳清蛋白pET30a(+)原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and characterization of prokaryotic expression plasmid of human α-lactalbumin using pET30a(+)plasmid vector

2.2 重組人α乳清蛋白的表達和純化

將pET30a-HLA-6×His質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，通過對裂解菌液的蛋白電泳分析，可見在預(yù)期相對分子質(zhì)量處有明顯的條帶，并且經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后預(yù)期的條帶顯著增強(圖2A)。為進一步確認(rèn)外源質(zhì)粒編碼蛋白的表達，我們利用抗His標(biāo)簽的單克隆抗體進行了Western blotting檢測，從而確定了HLA C端His標(biāo)簽融合蛋白的表達，特別是在IPTG誘導(dǎo)之后(圖2B)。結(jié)果同時還顯示大量表達的HLA融合蛋白定位于不溶性的包涵體，因而在純化前需要經(jīng)過變性-復(fù)性的過程。通過體外復(fù)性，可得到高豐度天然折疊(native fold)的重組蛋白。蛋白復(fù)性后經(jīng)過鎳離子親和層析，我們從原核表達菌裂解產(chǎn)物中獲得高純度的重組HLA(圖2C)。

圖2 重組HLA(rHLA)的分離和純化Fig.2 Isolation and purification of recombinant HLA

2.3 rHAMLET的制備和生化特征分析

通過對 HLA，apo-HLA和 BLA(PDB accession 1a4v，1f6s和1b9o)蛋白結(jié)構(gòu)進行比較(圖3A)，發(fā)現(xiàn)HLA和BLA空間結(jié)構(gòu)相似，因此我們選擇BLA作為HAMLET制備和結(jié)構(gòu)鑒定的陽性對照樣品。在rHAMLET制備過程中，通過對37℃加熱1 h處理后的rHAMLET及其各組對照樣品進行蛋白電泳分析，我們發(fā)現(xiàn)rHLA，rHAMLET和apo-rHLA的蛋白組分無明顯降解，除了單體蛋白(14～17 000)以外，與BAMLET相比，在25～30 000處可見更多的二聚體形成(圖3B)。此結(jié)果表明我們制備HAMLET的方法具備較好的質(zhì)量，并且提示可以通過自身的聚合現(xiàn)象介導(dǎo)針對細胞的活性功能。

通過對rHAMLET在250～300 nm下光譜曲線的變化分析，我們發(fā)現(xiàn)在0.9%NaCl中經(jīng)37℃孵育1 h后的rHAMLET和BAMLET有相似光譜特征，并且與單純的OA和復(fù)性后的rHLA存在顯著不同(圖3C)。通過進一步的ANS結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，rHAMLET和BAMLET的ANS結(jié)合活性顯著增加，使ANS最大發(fā)射波長遷移至450 nm(圖3D)，而OA和rHLA則無此現(xiàn)象。結(jié)果顯示rHAMLET、BAMLET與rHLA相比結(jié)構(gòu)更為松散，可暴露出更多的疏水區(qū)域與OA結(jié)合并且與ANS作用，從而進一步表明了我們所制備的rHAMLET具有與BAMLET相似的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并參與發(fā)揮類似的生物學(xué)活性。

圖3 重組HAMLET(rHAMLET)結(jié)構(gòu)及生化性質(zhì)與BAMLET的比較Fig.3 Biochemical analyses of rHAMLET in comparison with BAMLET produced by the classical method

2.4 rHAMLET對腫瘤細胞的殺傷活性檢測

HeLa細胞經(jīng)rHAMLET作用6 h后，通過MTS實驗檢測rHAMLET對腫瘤細胞的殺傷作用。結(jié)果顯示rHAMLET和BAMLET作用的HeLa細胞的存活率(10～25%)顯著低于高濃度的HLA，BLA以及OA處理組(80～90%)(圖4A)，同時，rHAMLET對HeLa細胞的殺傷作用呈現(xiàn)出與BAMLET處理組相似的劑量依賴性(圖4B)，表明我們用重組HLA制備的rHAMLET與用BLA純品制備的BAMLET同樣具有較強的腫瘤殺傷活性。

對rHAMLET和BAMLET處理后的HeLa細胞分別進行形態(tài)學(xué)觀察，可見顯著的細胞病變表現(xiàn)，胞體變圓、體積縮小、貼壁能力下降;同時由于部分細胞死亡，與HLA、BLA以及OA對照組相比細胞數(shù)顯著減少。在rHAMLET和 BAMLET處理后，HeLa細胞經(jīng)DAPI復(fù)染的細胞核與對照組相比，出現(xiàn)細胞核皺縮、形態(tài)變小、致密度增強、且部分細胞核出現(xiàn)碎裂等，提示細胞凋亡作用可能在很大程度上參與了rHAMLET和BAMLET的殺傷效應(yīng)(圖4C)。

圖4 rHAMLET對HeLa細胞的殺傷活性與BAMLET相似Fig.4 rHAMLET induced cell death in HeLa cells

2.5 rHAMLET可引起腫瘤細胞的凋亡

我們采用TUNEL染色法檢測了rHAMLET和BAMLET處理后細胞的凋亡指標(biāo)改變。TUNEL染色法在DNA的雙鏈斷裂產(chǎn)生缺口而出現(xiàn)的3'-OH末端，經(jīng)脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)催化，將其末端標(biāo)記上綠色熒光衍生物。實驗過程中我們同時以PI的紅色熒光復(fù)染視野中的全部細胞核，因而可以通過綠色與紅色熒光的比例判斷細胞出現(xiàn)凋亡的程度。結(jié)果如圖5所示，HeLa細胞經(jīng)rHAMLET和BAMLET作用6 h后，綠色熒光陽性的細胞顯著增多，且與紅色熒光的比例增加;同時，rHAMLET高濃度組比低濃度組相比，上述現(xiàn)象更加明顯，表明rHAMLET和BAMLET都可以引起HeLa細胞的凋亡，細胞的凋亡隨著rHAMLET濃度的升高而增多。

3 討論

HAMLET作為一種體外形成的蛋白/脂類復(fù)合物，卻可以選擇性的殺傷腫瘤細胞，其作用機制一直受到人們的關(guān)注。在惡性膠質(zhì)瘤細胞中，HAMLET可以吸附腫瘤細胞，迅速進入細胞核內(nèi)并聚集，而在成熟的正常細胞中，HAMLET只有少量在細胞質(zhì)中存在，主要在細胞膜上［4］。HAMLET在細胞內(nèi)的聚集可導(dǎo)致線粒體膜通透性增強等細胞內(nèi)的變化，引起細胞的凋亡［10-11］，但是也有報道［12］顯示細胞的死亡并未激活經(jīng)典的凋亡途徑。近來研究［13-14］發(fā)現(xiàn)原癌基因c-Myc和黏附分子 α-Actinin等［14］可以作為 HAMLET作用腫瘤細胞的靶點，為揭示HAMLET選擇性殺傷腫瘤細胞的機制提供了線索。

圖5 rHAMLET通過激活細胞凋亡誘導(dǎo)HeLa的細胞死亡Fig.5 Cell death of HeLa cells induced by rHAMLET treatments involved the activation of apoptosis as determined by TUNEL assays

HLA(人α乳清蛋白，相對分子質(zhì)量142 000)為123氨基酸組成的酸性鈣結(jié)合蛋白，主要有2個結(jié)構(gòu)域:包括一個α-螺旋結(jié)構(gòu)域包含4個α-螺旋(氨基酸殘基5-11，23-34，86-98和106-110)和一個由3個β-折疊組成的結(jié)構(gòu)域(41-43，48-50和55-56)(圖1A)。HLA的C端游離，未參與其功能結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定。因此，在C末端引入His標(biāo)簽，如本研究所證實，沒有影響HLA的結(jié)構(gòu)復(fù)性以及形成活性rHAMLET的能力。

HLA肽鏈在乳腺細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊(folded)生成具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白。原核表達細胞中的人，牛等［15-16］種屬的α乳清蛋白因折疊異常而主要存在于包涵體中，與本研究HLA-His融合蛋白表達的情況表現(xiàn)一致。HLA球形蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要依賴于鈣離子結(jié)合環(huán)(K79，D82，D84，D87和D88)和4個分子內(nèi)二硫鍵(6-12，61-77，73-91 和28-111)［17-18］，只有失去Ca2+后轉(zhuǎn)變成熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的apo-HLA，才具有結(jié)合油酸并形成HAMLET的能力［15］。所幸的是，HLA可在合適的含Ca2+電解質(zhì)中完成體外復(fù)性并恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)，使得本研究中的rHLA依然能夠用于HAMLET的制備，并表現(xiàn)出與天然蛋白相仿的細胞殺傷活力［8］。

我們的實驗結(jié)果顯示融合His標(biāo)簽的HLA能夠在37℃條件下部分形成二聚體，多聚體形式的HLA，稱為 MAL(multimers of α-lactalbumin)，被認(rèn)為很可能是HAMLET的活性組成，引起腫瘤細胞的凋亡［19］。OA的存在使rHAMLET暴露更多疏水結(jié)構(gòu)，與Atri等［20］報道的LA-OA-60復(fù)合物結(jié)構(gòu)變化相似，本研究中紫外光譜分析和ANS結(jié)合實驗結(jié)果表明rHAMLET和BAMLET比rHLA形成更多的穩(wěn)定二聚體。因此，雖然由rHLA和油酸所制備的rHAMLET復(fù)合物具有與經(jīng)典的BAMLET相似的腫瘤殺傷活性［12］，可以引起HeLa細胞的凋亡樣的死亡，但在其細胞內(nèi)代謝、生物學(xué)效應(yīng)和作用機制等方面可能存在些微的不同。

HAMLET作為腫瘤細胞的選擇性殺傷制劑逐漸引起越來越多的興趣和重視，改善其制備策略和方法成為近年來相關(guān)研究的重點之一［21］。本研究所完成的通過融合His標(biāo)簽HLA制備HAMLET的方法，有效地解決了HLA在天然原料中豐度較低，高純度純化步驟復(fù)雜和困難等問題;同時與傳統(tǒng)的離子交換層析方法相比更為簡單，且生產(chǎn)成本更加經(jīng)濟。所得到的純化rHLA，可以規(guī)?；糜赼po-HLA的制備，并且非常適合在OA混合加熱法［22-23］，這一迄今為止最為簡便的HAMLET生產(chǎn)方法中應(yīng)用。本研究所提供的rHAMLET制備方法和產(chǎn)品，為HAMLET的規(guī)?；a(chǎn)提供了可靠的依據(jù)，為HAMLET在更多、更廣泛的使用，包括在大型動物模型中的應(yīng)用等，奠定了重要的基礎(chǔ)。與此同時，rHAMLET還可以幫助對HAMLET及其類似物的作用機制研究，如可通過anti-His抗體pull-down和后續(xù)的蛋白相互作用實驗研究其在腫瘤細胞中的作用靶點等。因此，本研究在HAMLET功能機制探討和在腫瘤臨床前期應(yīng)用中均有可觀的潛在價值。

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