張宏偉 張 彤 夏 煒 吳 昊

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京100069)

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的以 CD+4T淋巴細(xì)胞免疫功能缺陷為主的一種綜合性免疫缺陷疾病。自1981年首次報(bào)道［1］以來(lái)，經(jīng)過(guò)30多年的醫(yī)學(xué)研究，已研發(fā)出30余種抗HIV藥物，通過(guò)使用這些藥物聯(lián)合抗病毒治療，使艾滋病發(fā)生率和病死率顯著降低，從而使艾滋病從一種被早期醫(yī)學(xué)宣判為死刑的疾病轉(zhuǎn)為一種可治療和可控制的慢性疾?。?-3］。然而，現(xiàn)有的抗病毒治療仍存在局限性，一方面無(wú)法清除體內(nèi)的病毒，需要終身治療，給患者和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān);另一方面長(zhǎng)期抗病毒治療可能會(huì)產(chǎn)生潛在的不良反應(yīng)以及耐藥，從而導(dǎo)致治療失?。?-5］。

縱觀人類與疾病斗爭(zhēng)的歷史，無(wú)數(shù)事實(shí)都證明，唯有疫苗才是控制傳染病最有力和最經(jīng)濟(jì)的武器。從20世紀(jì)80年代后期開(kāi)始，國(guó)際醫(yī)學(xué)界把艾滋病疫苗的研制提到了與開(kāi)發(fā)治療藥物同等重要的位置。但時(shí)至今日，整個(gè)研究領(lǐng)域仍然沒(méi)有明確的方向［6］。傳統(tǒng)的滅活疫苗無(wú)法抵御HIV感染，而減毒活病毒疫苗的安全性是一個(gè)值得考慮的問(wèn)題。DNA疫苗在人體的免疫原性較低，表位肽疫苗僅限于HLA表型相配的個(gè)體，疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答譜較窄，而且鑒定表位和HLA分型也是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)而又費(fèi)力的過(guò)程［7］。

我們采用重組重疊肽策略克服HLA限制性有關(guān)問(wèn)題，并與相應(yīng)蛋白進(jìn)行比較，免疫接種2個(gè)種系的小鼠，采用ELISPOT和ICS方法檢測(cè)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，采用高劑量痘苗病毒攻擊試驗(yàn)檢測(cè)疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)性。

1 材料和方法

1.1 材料

表達(dá)重疊肽的pET16b質(zhì)粒由牛津大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所姜石松博士提供，重疊肽覆蓋HIV-1 Lai Nef全長(zhǎng)(202氨基酸)，共計(jì)20個(gè)肽段(分別以P1～P20表示)，每個(gè)肽段長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸(第20個(gè)肽段長(zhǎng)度為12個(gè)氨基酸)，相鄰肽段之間重疊10個(gè)氨基酸，肽段之間以凝血第10因子裂解位點(diǎn)連接，重組重疊肽(recombinant overlapping peptide，ROPp)及其相應(yīng)蛋白(以ROP表示)的表達(dá)和純化參見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)［8］。胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)和RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó) Gibico公司，IFN-(ELISPOT試劑盒購(gòu)自瑞典Mabtech公司，F(xiàn)ITCIFN-γ/PE-CD8/PerCP-CD4購(gòu)自英國(guó) BioInsight公司。6～8周齡雌性BLAB/c和C57BL/10小鼠購(gòu)自牛津大學(xué)動(dòng)物所。

1.2 免疫小鼠

C57BL/10或BALB/c小鼠首次免疫給予200 μg Nef ROPp或ROP混懸于100 μL弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)皮下注射。對(duì)照組小鼠單獨(dú)給予100 μL CFA。每隔3周給予1次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫的疫苗與首次免疫相同，但均混懸于100 μL弗氏不完全佐劑中。第2次加強(qiáng)免疫后3周，采集脾臟進(jìn)行IFN-γ ELISPOT試驗(yàn)和胞內(nèi)細(xì)胞染色(每組5只小鼠)，或進(jìn)行病毒攻擊試驗(yàn)(每組10只小鼠)。

1.3 ELISPOT試驗(yàn)

小鼠處死后，分離脾臟，以鋼網(wǎng)研磨法制備脾細(xì)胞懸液，以密度梯度離心法制備脾單個(gè)核細(xì)胞(spleen mononuclear cell，SMC)，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×106/mL備用。

ELISPOT參照Mabtech公司的操作說(shuō)明書，在96孔板每孔中加入100 μL用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)以1/1 000比例稀釋的包被抗體，置于4℃冰箱過(guò)夜。在使用前將該板用180 μL無(wú)菌PBS洗4遍。每孔加入100 μL 10%FCS/RPMI1640，于37℃放置1 h。在實(shí)驗(yàn)組孔中加入100 μL細(xì)胞及100 μL肽段，濃度分別為5×106/mL和10 μmol/L;陽(yáng)性對(duì)照孔中加入終濃度為0.5 ng/L的刀豆蛋白A，陰性對(duì)照加入100 μL 10%FCS/RPMI1640。將板置于37℃、5%CO2孵育箱中孵育16～18 h。取出96孔板后，甩去細(xì)胞及培養(yǎng)液，每孔加入200 μL冰水，在4℃放置5 min，以200 μL PBS洗6遍。每次更換洗液時(shí)用排槍吹打孔底，以便沖洗干凈。每孔加入100 μL按1/1 000稀釋在PBS中的檢測(cè)抗體，置于室溫孵育2 h。以200 μL PBS洗6遍后，加入100 μL按1/1 000比例稀釋在PBS中的抗生物素堿性磷酸酶結(jié)合物，置于室溫孵育1 h。再以200 μL PBS洗6遍。每孔加入100 μL底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑氮藍(lán)，室溫反應(yīng)20～30 min。自來(lái)水沖洗，潔凈臺(tái)風(fēng)口處吹干，避光保存，次日讀板。采用AID ELISPOT進(jìn)行讀板并計(jì)數(shù)斑點(diǎn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。ELISPOT的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為:細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)≥10 SFU/106細(xì)胞，且高于陰性對(duì)照2倍。

1.4 胞內(nèi)細(xì)胞染色

在96孔板中每孔加入100 μL SMC細(xì)胞懸液以及相應(yīng)刺激原如10 μmol/L合成的重疊肽第8號(hào)肽段(P8)或陽(yáng)性對(duì)照刀豆蛋白A，37℃孵育6 h，在孵育1.5～2 h內(nèi)加入布雷菲德菌素A。

每孔以200 μL 5%FCS/PBS洗滌細(xì)胞2次，以5%FCS/PBS 1:200稀釋CD16/CD32，每孔中加入30 μL稀釋液，混勻后置于室溫避光孵育10 min或置于4℃避光孵育20 min，以阻斷非特異性CD4結(jié)合位點(diǎn)。洗滌2次，以5%FCS/PBS緩沖液1:100稀釋熒光抗體，每孔中加入30 μL稀釋的單克隆熒光抗體 PECD8/PerCP-CD4;陰性對(duì)照以加入 PE-(/PE-CY5-(?；靹蚝笾糜?℃避光孵育20 min。洗滌2次后每孔加入100 μL Cytofix/Cytoperm固定和穿孔液，混勻后置于4℃避光孵育20 min，再洗滌2次后以FACS緩沖液1:100稀釋熒光抗體FITC-IFN-γ，陰性對(duì)照以加入FITC-(，混勻后置于4℃避光孵育20 min。洗滌后，每孔中加入250 μL細(xì)胞固定液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 痘苗病毒攻毒保護(hù)試驗(yàn)

由于HIV-1不能感染小鼠，因此，采用可以感染小鼠且含有HIV-1 Nef基因的痘苗病毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。在末次免疫小鼠3周時(shí)，腹腔注射痘苗病毒，劑量為3×108PFU，連續(xù)8 d觀察小鼠的存活情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答

對(duì)于佐劑組、ROP組和ROPp組免疫的C57BL/10小鼠，在特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答寬度方面，佐劑組對(duì)于LAI Nef中的所有肽段均為陰性，ROP組對(duì)于LAI Nef中的P1、P2、P5、P7、P8、P15 和 P20 細(xì)胞免疫應(yīng)答為陽(yáng)性，而ROPp組對(duì)于LAI Nef所有20個(gè)肽段的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答均為陽(yáng)性;在反應(yīng)強(qiáng)度方面，ROP組為(24.2±10.2)SFU/106SMC，ROPp組為(145.7±36.2)SFU/106SMC，ROPp組顯著高于ROP組(t=-7.229，P=0.001)。

在BALB/c小鼠中，我們也比較了ROP和ROPp之間的細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。在免疫應(yīng)答寬度方面，ROP組對(duì)P9、P11、P13和P18細(xì)胞免疫應(yīng)答為陽(yáng)性，ROPp組除此之外，還對(duì)P1、P2、P5、P6、P19和P20細(xì)胞免疫應(yīng)答為陽(yáng)性。在細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度方面，ROP組為(19.8±9.0)SFU/106SMC，ROPp組為(148.8±50.4)SFU/106SMC。ROPp組顯著高于ROP組(t=-5.635，P=0.004)。

2.2 特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的交叉反應(yīng)

對(duì)于HIV-1 LAI Nef免疫的小鼠，我們采用HIV-1 NL4-3病毒株的Nef進(jìn)行Elispot試驗(yàn)，檢測(cè)免疫接種誘導(dǎo)的交叉反應(yīng)，研究結(jié)果顯示，在LAI Nef免疫的C57BL/10小鼠中，ROP組為(20.7±9.5)SFU/106SMC，ROPp組為(104.0 ±33.8)SFU/106SMC。ROPp組顯著高于ROP組(t=-5.297，P=0.004)。

表1 HIV Nef重組重疊肽與相應(yīng)蛋白細(xì)胞免疫強(qiáng)度比較Tab.1 Comparison of cellular immune intensity of HIV Nef recombinant/overlapping peptide and corresponding protein (n=5，±s)

表1 HIV Nef重組重疊肽與相應(yīng)蛋白細(xì)胞免疫強(qiáng)度比較Tab.1 Comparison of cellular immune intensity of HIV Nef recombinant/overlapping peptide and corresponding protein (n=5，±s)

Investigated in mice ROP ROPp t/P C57BL/10 24.2±10.2 145.7±36.2 -7.229/0.001 BALB/c 19.8±9.0 148.8±50.4 -5.635/0.004 LAI Nef immunogenic C57BL/10 20.7±9.5 104.0±33.8 -5.297/0.004

2.3 特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的亞群類型

在Elispot試驗(yàn)中我們觀察到ROPp免疫的小鼠對(duì)于P8的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答較強(qiáng)，為了進(jìn)一步觀察這些特異性細(xì)胞的亞群類型，我們?cè)隗w外以P8刺激免疫的小鼠脾細(xì)胞，采用胞內(nèi)細(xì)胞染色的方法檢測(cè)特異性細(xì)胞應(yīng)答的比例和類型。結(jié)果顯示，分泌INF-γ特異性CD4細(xì)胞的百分比在ROP組和ROPp組分別為0.63和1.53，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.380，P=0.001)。分泌INF-γ特異性CD8細(xì)胞的百分比在ROP組和ROPp組分別為0.26和0.80，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.754，P=0.006)。在ROPp組，與特異性CD8細(xì)胞(0.80)相比，特異性CD4細(xì)胞(1.53)所占的比例較高(t=3.741，P=0.006)。

2.4 痘苗病毒攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

病毒攻擊后，10只未免疫的小鼠于第1天6例出現(xiàn)死亡，第2天全部死亡;單純佐劑組在第1天5只出現(xiàn)死亡，第2天3只出現(xiàn)死亡，觀察至第8天未再出現(xiàn)死亡;ROP組在第2天2只出現(xiàn)死亡，第5天4只出現(xiàn)死亡，觀察至第8天未再出現(xiàn)死亡;ROPp組在第1天2只出現(xiàn)死亡，觀察至第8天未再出現(xiàn)死亡。重疊肽組小鼠的存活率80%(8/10)顯著高于佐劑組20%(2/10)，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，檢驗(yàn)值為6.840，P=0.023。

3 討論

重疊肽疫苗是一種全新的疫苗設(shè)計(jì)理念，它克服了表位肽疫苗HLA限制相關(guān)問(wèn)題，無(wú)需了解接種人群遺傳背景，在應(yīng)用上具有表位肽無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但在免疫接種效果上，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用HIV-1 Nef為例證，探討了重組重疊肽疫苗在細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)方面的效果。

Nef作為HIV附屬蛋白之一，相對(duì)分子質(zhì)量較小，具有一些保守模體，這是我們選擇Nef的主要依據(jù)。以往關(guān)于疫苗的研究中，也有許多以Nef為靶向的報(bào)道［9-11］。齊香榮等［11］的研究以含有 Nef的疫苗為例，探討了復(fù)制型和非復(fù)制型疫苗的聯(lián)合使用效果。而周東霞等［9］研究則以 Nef為例探討了 HIV DNA疫苗的免疫效果，其研究結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX-nef免疫小鼠后可有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，但誘導(dǎo)的CTL表位不夠理想。

我們的結(jié)果顯示，采用重組重疊肽免疫小鼠后，在不同株系的小鼠中均可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，說(shuō)明重組重疊肽具有較強(qiáng)的免疫原性，且與相應(yīng)的蛋白相比更勝一籌。由于我們沒(méi)有采用DNA疫苗進(jìn)行對(duì)比，而且不同的試驗(yàn)的條件不同，所以無(wú)法判斷重組重疊肽疫苗與DNA疫苗之間何者的免疫原性更高。采用不同株系的病毒進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，重組重疊肽免疫的小鼠可產(chǎn)生交叉性特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。這可能與Nef序列的保守性有關(guān)。

在抗病毒免疫應(yīng)答中，CD+8T細(xì)胞主要發(fā)揮免疫殺傷作用［12］，而CD4輔助細(xì)胞對(duì)于整個(gè)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，包括效應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和B細(xì)胞的產(chǎn)生具有十分重要的作用［13-14］。測(cè)定免疫接種后免疫應(yīng)答的細(xì)胞類型對(duì)于探討免疫應(yīng)答的機(jī)制具有十分重要的作用。本文的結(jié)果顯示，在重組重疊肽誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答中，以CD4細(xì)胞為主，而CD8細(xì)胞也占有一定的比例，這種特點(diǎn)對(duì)于特異性細(xì)胞免疫和體液免疫的產(chǎn)生和調(diào)控可能有益。

研制疫苗的最終目的是產(chǎn)生切實(shí)的保護(hù)作用。在艾滋病的疫苗研制中，一個(gè)最為棘手的問(wèn)題是攻毒保護(hù)試驗(yàn)［15］，因?yàn)镠IV具有種屬特異性，HIV不能感染小鼠，我們采用含有Nef基因的痘苗病毒進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，與佐劑組和重疊肽蛋白組相比，重組重疊肽疫苗具有顯著的保護(hù)作用。盡管這一結(jié)果并不能說(shuō)明該種疫苗能夠保護(hù)人類抵御HIV感染，但對(duì)于了解重疊肽疫苗的實(shí)際效果具有十分重要的意義，對(duì)于其他病毒疫苗的研制也具有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，重組重疊肽疫苗克服了多肽疫苗中HLA限制的相關(guān)問(wèn)題，在小鼠模型中可產(chǎn)生較強(qiáng)的廣譜的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)于不同病毒株系的Nef具有交叉反應(yīng)。重組重疊肽疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強(qiáng)度顯著高于相應(yīng)蛋白組。更為可貴的是，這種疫苗具有保護(hù)作用。重組重疊肽疫苗在艾滋病領(lǐng)域值得進(jìn)一步深入研究。

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