龐學(xué)燕 季 昀 王洪榮 魏宗友 王夢芝

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 2 25009)

近年來，人們對乳品質(zhì)的要求越來越高，乳蛋白作為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，其合成的營養(yǎng)調(diào)控已成為奶牛營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。乳蛋白大部分是由奶牛乳腺上皮細(xì)胞從頭合成和分泌的，80%的乳蛋白由酪蛋白組成，而牛乳中的酪蛋白主要由 αs－ 酪蛋白(αs－casein)組成(45% ～ 55%)［1］，因此研究調(diào)控αs－酪蛋白的合成具有重要意義。目前，檢測牛乳或乳腺細(xì)胞合成分泌的酪蛋白最常用的方法主要包括酶聯(lián)免疫(ELISA)法和免疫印跡(Western－blot)法，而這2種方法均需用到酪蛋白抗體，目前沒有商品化的奶牛αs－酪蛋白抗體，因此本試驗(yàn)通過免疫新西蘭兔來制備兔抗牛αs－酪蛋白多克隆抗體，旨在為研究奶牛αs－酪蛋白合成的調(diào)控提供有效的試驗(yàn)材料。為得到純度較高、特異性較強(qiáng)的抗體，本試驗(yàn)通過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂對抗血清進(jìn)行2次純化，純化后得到的抗體用Western－blot法鑒定其與 αs－酪蛋白純品及乳腺組織中αs－酪蛋白的有無特異性反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括αs－酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，純度≥70%)、弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)、弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司)、蛋白A樹脂(美國Genscript公司)、羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG－HRP)(武漢博士德公司)、豬源明膠(美國Amresco公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(上海生工生物工程公司)、放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液(上海碧云天公司)、2，2－聯(lián)喹啉 －4，4－二甲酸二鈉(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)

試驗(yàn)動物選用4只健康純種新西蘭大白兔(購自南京金陵種兔廠)，飼養(yǎng)前對兔舍進(jìn)行徹底清掃和消毒，采用單籠飼養(yǎng)，每日飼喂顆粒飼料(飼料中不含酪蛋白)3次，自由飲水。待兔適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境約1周后，耳緣靜脈采血約1 mL，采用ELISA法測試其血清是否與αs－酪蛋白有反應(yīng)性，無反應(yīng)性的合格兔子按免疫程序進(jìn)行免疫。

1.3 免疫程序

免疫程序見表1，每次免疫前將弗氏佐劑與αs－酪蛋白溶液按1∶1徹底混合乳化后，采用皮下多點(diǎn)注射法，每只兔注射1 mL乳化液(含800 μg αs－酪蛋白)。免疫結(jié)束后的第5～7天耳緣靜脈采血，參考楊苗等［2］的ELISA法檢測抗血清效價，效價達(dá)到1∶10 000時立即準(zhǔn)備放血。

表1 αs－酪蛋白免疫程序Table 1 Immunizing schedule of αs－casein

1.4 抗血清的制備

放血采用頸動脈放血法，用1%戊巴比妥鈉經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注射麻醉，使兔仰臥并固定，分離兩側(cè)頸總動脈，插管放血，待血凝結(jié)后，于3 000 r/min離心10 min，取上清分裝后置－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 飽和硫酸銨純化

飽和硫酸銨純化參考張和平等［3］的方法，略有改動。取500 μL血清加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)，冰浴下逐滴加入250 μL飽和硫酸銨溶液，旋渦混勻，4℃靜置30 min，4 ℃、4 000 r/min 離心 15 min，取上清液。在上清液中逐滴加入1 000 μL飽和硫酸銨溶液，旋渦混勻，4℃靜置30 min，離心棄上清。沉淀用500 μL PBS溶解，在溶液中逐滴加入250 μL 飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，4℃靜置30 min，4℃離心，保留沉淀。沉淀繼續(xù)用PBS溶解，滴加飽和硫酸銨溶液，靜置，離心，保留沉淀。將沉淀溶于PBS中，裝入透析袋中4℃透析過夜。

1.6 蛋白A樹脂純化

向純化柱中加入1 mL結(jié)合/洗滌緩沖液，將1 mL混勻的蛋白A樹脂加入柱中，再向柱中加入5 mL結(jié)合/洗滌緩沖液以平衡柱子，流速約1 mL/min。將結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋后血清樣本加入柱中，保持流出速度約為1 mL/min。用30 mL結(jié)合/洗滌緩沖液沖洗柱子并使緩沖液流出速度約2 mL/min，用15 mL洗脫緩沖液洗脫抗體，保持洗脫液流速約1 mL/min。將含有抗體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的燒杯中以中和洗脫液pH至7.4。洗脫出來的抗體溶液裝入透析袋中4℃透析過夜。

1.7 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)鑒定純化后抗體純度

配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，取80 μL抗體樣品與20 μL 5×上樣緩沖液混勻，在沸水中煮沸5 min。每孔上樣12 μL，電壓調(diào)為80 V開始電泳，當(dāng)指示染料進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距分離膠下端約1 cm處停止電泳，固定液固定，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色，直至條帶清晰可辨，用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.8 ELISA法檢測純化后抗體的效價

將 αs－酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用包被液稀釋至20 μg/mL，每孔 100 μL 包被酶標(biāo)板過夜，并用PBS做陰性對照，用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，每次靜置5 min后迅速傾去洗滌液。每孔中加入200 μL封閉液(1%豬源明膠)，置37℃恒溫箱1 h，洗滌，傾去液體。取不同稀釋度的純化后的抗體(1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400和1∶12 800)，每個稀釋度5個重復(fù)，37℃溫育1 h，然后傾去液體，PBST洗滌，傾去液體。每孔加100 μL 按 1∶5 000 稀釋的羊抗兔 IgG－HRP 抗體，37℃溫育1 h，PBST反復(fù)洗滌，傾去液體。每孔加入100 μL底物溶液室溫孵育15 min。每孔加入 100 μL 硫酸(H2SO4，2 mol/L)，5 min 后在酶標(biāo)儀上測定450 nm下的吸光度值。

1.9 Western－blot法鑒定純化后抗體特異性

1.9.1 純化后抗體與αs－酪蛋白純品反應(yīng)性鑒定

配制12%的分離膠和5%的濃縮膠對αs－酪蛋白溶液進(jìn)行SAS－PADE，電泳結(jié)束后，根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指示進(jìn)行切膠，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(60 V恒壓2 h)。用3%豬源明膠室溫封閉1.5 h，然后將抗體溶液按1∶1 600稀釋后，室溫孵育1.5 h，PBST洗膜，用羊抗兔IgG－HRP(1∶5 000稀釋)室溫孵育1.5 h，PBST洗膜，DAB顯色劑顯色，掃描觀察結(jié)果。

1.9.2 純化后抗體與奶牛乳腺組織αs－酪蛋白反應(yīng)性鑒定

將從屠宰場采集的鮮活奶牛乳腺組織剪成細(xì)小碎片于－80℃凍存。鑒定時取出凍存的組織加液氮研磨并用RIPA裂解液將其充分裂解后，14 000×g離心5 min，移取上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，SAS－PADE電泳，轉(zhuǎn)膜，1抗、2抗雜交，DAB顯色觀察(詳細(xì)條件同1.9.1)。

2 結(jié)果

2.1 αs－酪蛋白抗體純度

SDS－PAGE結(jié)果(圖1)顯示，經(jīng)過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂2步純化后得到的αs－酪蛋白抗體重鏈清晰可見，表明通過純化得到了純度較高的αs－酪蛋白抗體。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker，1 ～4:αs－ 酪蛋白抗體 Antibody against αs－casein。圖1 SDS－PAGE鑒定αs－酪蛋白抗體純度Fig.1 Identification of purity of antibody against αs－casein by SDS－PAGE

2.2 αs－酪蛋白抗體效價

經(jīng)過純化以后，ELISA法檢測抗體的效價為1∶1 600。

2.3 αs－酪蛋白抗體特異性

Western－blot結(jié)果(圖 2)顯示，純化后的抗體能夠與αs－酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品專一性結(jié)合，表明得到的抗體能夠特異性識別αs－酪蛋白。

圖2 Western－blot法鑒定αs－酪蛋白抗體特異性Fig.2 Identification of specificity of antibody againstαs－casein by the method of Western－blot

Western－blot結(jié)果(圖 3)顯示，純化后的抗體與奶牛乳腺組織中提取的αs－酪蛋白具有反應(yīng)性，表明得到的抗體可以用于特異性檢測奶牛乳腺組織αs－酪蛋白的含量。

圖3 Western－blot法鑒定抗體與奶牛乳腺組織中提取的αs－酪蛋白的反應(yīng)性Fig.3 Identification of reactivity of antibody against αs－casein extracted from bovine mammary gland tissues by the method of Western－blot

3 討論

與制備抗體相比，制備抗血清無需進(jìn)行純化相對容易，國內(nèi)學(xué)者李震等［4］、張濤等［5－6］相繼成功制備了兔抗牛β－酪蛋白、αs－酪蛋白和κ－酪蛋白的抗血清，但由于未經(jīng)純化的抗體純度不高，其他物質(zhì)可能影響到抗體與抗原的作用，因此有必要對抗體進(jìn)行純化。常見的抗體純化的有效方法包括離子交換層析法、鹽析法和親和層析法。離子交換層析法是利用蛋白質(zhì)與離子交換樹脂的選擇性結(jié)合來達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的［7］，Majidi等［8］利用 DEAE－Sepharose Fast Flow 柱進(jìn)行離子交換層析得到了高純度的兔抗牛IgG。鹽析法主要是利用蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中聚集形成沉淀的原理來進(jìn)行純化的［7］，宋宏新等［9］用飽和硫酸銨分級沉淀法純化了兔抗牛β－酪蛋白多克隆抗體，張和平等［3］對飽和硫酸銨法純化血清中免疫球蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化。飽和硫酸銨法具有方便、廉價、高效等優(yōu)點(diǎn)，但該法純化后的抗體純度為75%～80%，而親和層析法的純化后的抗體純度高達(dá)90%以上，該法是利用蛋白質(zhì)與介質(zhì)中的配基特異性結(jié)合的原理來分離純化蛋白質(zhì)的［7］，蛋白A和蛋白G樹脂是從細(xì)菌細(xì)胞壁中得到的能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白的介質(zhì)，能夠有效地分離提純哺乳動物的多克隆抗體［10］，楊苗等［2］用蛋白G樹脂成功純化了兔抗牛β－酪蛋白多克隆抗體，Vítková 等［11］用蛋白 A 樹脂純化了兔源多克隆抗體，并成功用于乳中α－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白的檢測。盡管蛋白A和蛋白G樹脂純化多克隆抗體得到的免疫球蛋白純度較高，但這種樹脂價格昂貴，而且多次反復(fù)使用后與免疫球蛋白的結(jié)合活性降低，基于此，為了提高蛋白A樹脂的使用壽命，本試驗(yàn)先用飽和硫酸銨對抗體進(jìn)行粗提純后再用蛋白A樹脂進(jìn)行親和層析純化，最終得到了純度較高的抗體，而且能夠特異性與αs－酪蛋白發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，并成功用于鑒定奶牛乳腺組織中 αs－酪蛋白的合成。

隨著動物營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，以組織、細(xì)胞為模型研究營養(yǎng)調(diào)控機(jī)理已逐漸成為熱點(diǎn)，蛋白質(zhì)和肽作為細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的產(chǎn)物，用免疫學(xué)方法鑒定這些產(chǎn)物常常要用到抗體，而商品化的抗體種類的不足往往難以滿足所有科研的需求，因此，有必要建立一套系統(tǒng)、可靠的實(shí)驗(yàn)室制備抗體的方法來滿足鑒定蛋白質(zhì)、肽的需要。本試驗(yàn)成功制備了高純度和特異性的兔抗牛αs－酪蛋白多克隆抗體，為進(jìn)一步研究通過營養(yǎng)素調(diào)控奶牛αs－酪蛋白的合成提供了有效的試驗(yàn)材料。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過免疫新西蘭大白兔成功制備了純度較高、特異性較強(qiáng)的兔抗牛αs－酪蛋白抗體，可以用于鑒定奶牛乳腺合成的αs－酪蛋白，為后續(xù)奶牛αs－酪蛋白合成調(diào)控的研究工作的開展奠定了基礎(chǔ)。

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