嚴(yán) 峰 趙 峰 米寶民 張 莉 齊智利 張宏福

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 4 30070)

在家禽體外模擬消化方法的研究中，模擬小腸液的制備一直是該領(lǐng)域的核心技術(shù)之一［1］。如何在定量確保模擬小腸液消化能力的前提下，兼顧消化酶的來(lái)源與被模擬動(dòng)物體內(nèi)的消化酶具有種屬的同源性，是進(jìn)一步提高模擬小腸液仿真程度的關(guān)鍵。長(zhǎng)期以來(lái)，人們?cè)谇萦媚M小腸液的制備上，多以一定濃度的豬源性胰液素或試劑級(jí)胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶等來(lái)制備模擬小腸液［2－5］，這種制備方法從消化酶的活性水平與同源性上都與動(dòng)物體內(nèi)腸液相差甚遠(yuǎn)。近年來(lái)，謝木林等［6］研究發(fā)現(xiàn)，鴨空腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶這4種主要酶的消化能力占腸液所有酶消化總能力的86.39%以上，對(duì)收集的鴨空腸液初提純成粉劑后，通過(guò)試劑酶調(diào)節(jié)這4種主要消化酶的活性，制備的模擬鴨腸液的消化能力為體內(nèi)腸液消化能力的100.1%～103.5%。由此表明，以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，加入部分試劑酶調(diào)節(jié)4種主要消化酶的活性后，可以獲得滿(mǎn)意的模擬鴨腸液制備效果，并在消化酶來(lái)源的同源性上有較大改善。然而，不同批次的鴨腸液酶粉劑與試劑酶組合后制備的模擬鴨腸液的消化能力是否有差異?鴨腸液酶粉劑與試劑酶對(duì)主要消化酶活性的貢獻(xiàn)在什么范圍內(nèi)不會(huì)影響模擬鴨腸液的消化能力?這2個(gè)問(wèn)題的探討對(duì)模擬鴨腸液消化能力的穩(wěn)定性至關(guān)重要。為此，本研究以3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過(guò)比較每批次酶粉劑內(nèi)，酶粉劑提供的主要消化酶活性與試劑酶提供的主要消化酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶，以胰蛋白酶為參照計(jì)算比例)活性不同配比時(shí)，制備的模擬鴨腸液對(duì)玉米、豆粕、小麥麩的干物質(zhì)消化率與酶水解物能值的影響，探討模擬鴨腸液的制備中鴨腸液酶粉劑與試劑酶的適宜配比。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料原料

選用健康、體重［(3.25±0.50)kg］基本一致的18周齡成年北京公鴨60只，隨機(jī)分成3組，每組20只。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室禽用T型套管安裝方法，在鴨空腸中部安裝套管并進(jìn)行相應(yīng)的術(shù)后護(hù)理［7］，試驗(yàn)期間試驗(yàn)鴨均飼喂基礎(chǔ)飼糧。為了考察模擬鴨腸液消化能力的差異，選擇3種常用飼料原料即玉米、豆粕和小麥麩。采用四分法取樣后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎并過(guò)60目篩，充分混合均勻，貯存于樣品瓶中－20℃保存?zhèn)溆?。飼料原料和基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼料原料和基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of feed ingredients and the basal diet %

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diet:VA 2 500 IU，VD 400 IU，VE 10 IU，VK30.5 mg，VB11.8 mg，VB24.0 mg，VB63.0 mg，VB120.007 mg，泛酸 pantothenic acid 11.0 mg，煙酸 nicotinic acid 55.0 mg，葉酸 folic acid 0.5 mg，生物素 biotin 0.12 mg，氯化膽堿 choline chloride 750 mg，Cu(as copper sulfate)8.0 mg，F(xiàn)e(as ferrous sulfate)80.0 mg，Zn(as zinc sulfate)40.0 mg，Mn(as manganese sulfate)60.0 mg，Se(as sodium selenite)0.15 mg，I(as potassium iodide)0.35 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were measured values.

1.2 鴨腸液酶粉劑的制備

試驗(yàn)鴨在安裝套管術(shù)后恢復(fù)30 d后，采用隔日重復(fù)采樣的方法于 09:30—10:30、13:30—14:30、17:30—18:30通過(guò)收集瓶在低溫條件下(0～4℃)收集鴨空腸食糜，搖勻后全部轉(zhuǎn)移至250 mL離心瓶中，于4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液裝于1 000 mL樣品瓶中，－20℃保存?zhèn)溆?。?個(gè)試驗(yàn)組分別收集到3 000 mL腸液后，4℃下解凍，過(guò)200目尼龍濾布，然后經(jīng)全自動(dòng)蛋白質(zhì)透析純化系統(tǒng)(型號(hào)PFS－1，自主研制)透析3 h去雜質(zhì)后，再通過(guò)冷凍干燥機(jī)(LG J－4，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)及乙醇脫脂凍干后得到鴨腸液酶粉劑。鴨腸液酶粉劑中主要消化酶及試劑酶的活性見(jiàn)表2。

表2 鴨腸液酶粉劑中主要消化酶及試劑酶的活性Table 2 Activities of main digestive enzymes in intestinal fluid dry powder of ducks and enzyme reagents U/g

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用嵌套設(shè)計(jì)，其中獨(dú)立變量為鴨腸液酶粉劑的批次來(lái)源，設(shè)3個(gè)處理水平，分別為鴨腸液酶粉劑批次1、2、3;嵌套變量為模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性比例(以胰蛋白酶為基礎(chǔ))，設(shè) 4個(gè)處理水平，即 0(共用)、25%、50%、75%(表3)。為了保證所有模擬鴨腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性水平與鴨體內(nèi)腸液相應(yīng)消化酶的活性水平一致［4］，各處理中，通過(guò)加入相應(yīng)數(shù)量的試劑級(jí)消化酶以調(diào)節(jié)模擬鴨腸液中主要消化酶的活性。利用單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)(SDS－2)，采用胃－小腸2階段消化，每種飼料原料設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1根消化管?？疾?0個(gè)模擬鴨腸液制備處理對(duì)玉米、豆粕、小麥麩干物質(zhì)消化率與酶水解物能值的影響。

1.4 測(cè)定方法

干物質(zhì)、總能的測(cè)定分別參照GB/T 6435—2006、ISO 9831—1998的方法進(jìn)行測(cè)定。仿生消化方法參照《單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)操作手冊(cè)》［8］。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

干物質(zhì)表觀消化率(ADMD，%)=

［(M1－M2)/M1］×100;

酶水解物表觀能值(AEHGE，MJ/kg)=［(E1－ E2)/M1］/1 000;干物質(zhì)真消化率(TDMD，%)=［(M1－

M2+M0)/M1］×100;

酶水解物真能值(TEHGE，MJ/kg)=

［(E1－ E2+E0)/M1］/1 000。

式中:M1為飼料原料樣品干物質(zhì)重量(g);M2為殘?jiān)晌镔|(zhì)重量(g);M0為消化酶干物質(zhì)殘留量(g);E1為飼料原料樣品總?cè)紵裏嶂?J);E2為殘?jiān)側(cè)紵裏嶂?J);E0為消化酶干物質(zhì)殘留量總能值(J)。

根據(jù)嵌套設(shè)計(jì)，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的MEANS模塊對(duì) ADMD、AEHGE、TDMD、TEHGE的基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行計(jì)算，GLM模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以Duncan氏法對(duì)獨(dú)立變量?jī)?nèi)嵌套變量間模擬鴨腸液對(duì)飼料原料的干物質(zhì)消化率和酶水解物能值進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的批次來(lái)源及活性貢獻(xiàn)對(duì)飼料原料干物質(zhì)消化率的影響

由表4可知，在模擬鴨腸液的消化酶來(lái)源對(duì)仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量的影響上，3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑的平均酶殘留量為0.086 9～0.092 6 g/樣，批次間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。在模擬鴨腸液中，同一鴨腸液酶粉劑批次內(nèi)均呈現(xiàn)出隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時(shí)，仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量依次顯著遞增，從0.067 7 g/樣增加到0.116 9 g/樣(P＜0.05)，且都顯著高于試劑酶制備的模擬鴨腸液的消化酶干物質(zhì)殘留量(P＜0.05)。這與本試驗(yàn)中純化的鴨腸液酶粉劑中有活性的消化酶含量不高，雜質(zhì)含量較高的材料狀況相對(duì)應(yīng)(表2)。

在模擬鴨腸液的消化酶來(lái)源對(duì)飼料原料干物質(zhì)消化率的影響上，3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液對(duì)玉米的干物質(zhì)表觀消化率(79.92%～80.10%)與真消化率(85.00% ～85.07%)均無(wú)顯著影響(P＞0.05);對(duì)豆粕的干物質(zhì)表觀消化率(61.68% ～62.41%)無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但對(duì)其真消化率(71.75% ～72.24%)有顯著影響(P＜0.05);對(duì)小麥麩的干物質(zhì)表觀消化率(44.41% ～44.66%)和真消化率(49.29% ～49.64%)均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。由于本試驗(yàn)3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液對(duì)玉米、豆粕、小麥麩的干物質(zhì)表觀消化率與真消化率的最大相對(duì)差值都在0.75%以?xún)?nèi)，處于SDS－2的測(cè)試精度范圍內(nèi)［12］，因此，認(rèn)為3個(gè)批次鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液在消化能力上是接近的。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與模擬鴨腸液處理水平Table 3 Experimental design and treatment levels of simulated intestinal fluid for ducks

模擬鴨腸液中消化酶的活性按照220 mL體積計(jì)算。The digestive enzyme activities of simulated intestinal fluid for ducks were measured in 220 mL.

在模擬鴨腸液中，同一鴨腸液酶粉劑批次內(nèi)均呈現(xiàn)出隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時(shí)，模擬鴨腸液對(duì)玉米、豆粕、小麥麩的干物質(zhì)表觀消化率依次顯著下降(P＜0.05)，但干物質(zhì)真消化率相對(duì)穩(wěn)定(最大絕對(duì)差值0.95%，相對(duì)差值0.95%)，且干物質(zhì)真消化率均顯著地高于由試劑酶制備的模擬鴨腸液對(duì)這3種飼料原料的干物質(zhì)真消化率(P＜0.05)。這表明，模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時(shí)，其對(duì)飼料干物質(zhì)的消化能力是比較穩(wěn)定的，以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)制備的模擬鴨腸液比由3種主要消化酶試劑制備的模擬鴨腸液對(duì)飼料干物質(zhì)的消化能力高。

2.2 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的批次來(lái)源及活性貢獻(xiàn)對(duì)飼料原料酶水解物能值的影響

由表5可知，在模擬鴨腸液的消化酶來(lái)源對(duì)仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量總能值的影響上，3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑的消化酶干物質(zhì)殘留量總能值為877.10～940.50 J/樣，批次間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。在模擬鴨腸液中，同一鴨腸液酶粉劑批次內(nèi)均呈現(xiàn)出隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時(shí)，仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留量總能值依次顯著遞增，從613.25 J/樣增加到1 120.13 J/樣(P＜0.05)，且都顯著高于試劑酶制備的模擬鴨腸液的消化酶干物質(zhì)殘留量總能值(P＜0.05)，這與鴨腸液酶粉劑添加量的變化趨勢(shì)是相對(duì)應(yīng)的。

在模擬鴨腸液的消化酶來(lái)源對(duì)飼料原料酶水解物能值的影響上，3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液對(duì)玉米的酶水解物表觀能值(16.21～16.33 MJ/kg)與真能值(16.74～16.85 MJ/kg)、豆粕的酶水解物表觀能值(14.25～14.32 MJ/kg)與真能值(15.26～15.35 MJ/kg)、小麥麩的酶水解物表觀能值(9.03～9.17MJ/kg)與真能值(9.53～9.65 MJ/kg)均無(wú)顯著影響(P＞0.05)，且其差值均在SDS－2的測(cè)試精度范圍內(nèi)［12］，這進(jìn)一步證明了不同批次來(lái)源的鴨腸液酶粉劑制備的模擬鴨腸液的消化能力是接近的。

在同一鴨腸液酶粉劑批次制備的模擬鴨腸液內(nèi)，隨著鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到75%時(shí)，模擬鴨腸液對(duì)玉米、豆粕、小麥麩的酶水解物表觀能值均呈顯著性遞減(P＜0.05)，對(duì)酶水解物真能值間也有顯著性影響(P＜0.05)，但鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到50%范圍內(nèi)，模擬鴨腸液對(duì)玉米、豆粕、小麥麩的酶水解物真能值相對(duì)穩(wěn)定(最大絕對(duì)差值0.17 MJ/kg，相對(duì)差值0.89%)，與鴨腸液酶粉劑貢獻(xiàn)75%的消化酶活性時(shí)配制的模擬鴨腸液的對(duì)應(yīng)值有較大差異，且均顯著高于由試劑酶制備的模擬鴨腸液對(duì)這3種飼料原料的酶水解物真能值(P＜0.05)。這表明，模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑提供的消化酶活性的比例從25%增加到50%時(shí)，其對(duì)飼料有機(jī)物的消化能力是比較穩(wěn)定的。

3 討論

3.1 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的批次來(lái)源對(duì)飼料原料消化能力的影響

在體外模擬消化中，主要消化酶的動(dòng)物種屬來(lái)源可能會(huì)影響消化液所表現(xiàn)的綜合酶學(xué)特性。據(jù)Irene等［9］報(bào)道，從生長(zhǎng)豬與肉雞體內(nèi)獲得的胃蛋白酶在酶學(xué)特性(針對(duì)不同底物的最適pH、消化能力)上存在著較大的差異。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，人們?cè)诩仪蒹w外模擬消化方法的研究上，都采用豬小腸液［10－11］或豬胰液素［12］等豬源性消化酶來(lái)模擬家禽的小腸液。這種方法制備的家禽模擬小腸液可能與體內(nèi)小腸液的酶學(xué)特性有一定偏差。為此，本實(shí)驗(yàn)室前期在建立了家禽腸道食糜的連續(xù)采集方法［7］、冷凍濃縮－透析－冷凍干燥制備鴨腸液酶粉劑的粗提純方法［1］的基礎(chǔ)上，研究了以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過(guò)加入少量試劑酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)制備的模擬鴨腸液的消化能力為對(duì)應(yīng)消化酶活性的鴨體內(nèi)空腸液消化能力的100.1%～101.8%(4種飼料原料，4種飼糧)［6］。由此表明，以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)幾種主要消化酶的活性與體內(nèi)腸液的消化酶活性相一致，可能是解決模擬鴨腸液同源性問(wèn)題的有效手段。然而，以不同批次來(lái)源的鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)幾種主要消化酶的活性到同一水平制備的模擬鴨腸液是否具有相同的消化能力是檢驗(yàn)通過(guò)該方法能否制備穩(wěn)定模擬鴨腸液的關(guān)鍵問(wèn)題之一。本試驗(yàn)中，以3個(gè)批次的鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)制備的模擬鴨腸液對(duì)玉米、豆粕和小麥麩3種飼料原料的干物質(zhì)真消化率和酶水解物真能值的最大差異不超過(guò)0.60%，這一差異處于 SDS－2測(cè)試的系統(tǒng)誤差范圍之內(nèi)［13］。由此可見(jiàn)，以不同批次來(lái)源的鴨腸液酶粉劑為主要酶源制備的模擬鴨腸液的消化能力是穩(wěn)定的。

?

?

3.2 模擬鴨腸液中鴨腸液酶粉劑的活性貢獻(xiàn)對(duì)飼料原料消化能力的影響

在模擬鴨腸液制備的消化酶活性的定量水平上，Valdes等［12］以4 mg/mL胰液素為主要酶源制備模擬雞腸液，Clunies等［14］以豬小腸液(空腸食糜離心后的上清液)直接用于模擬雞空腸液。這些制備方法除了在消化酶的種屬同源性上與家禽體內(nèi)的消化酶不同外，在消化酶的活性水平上也與動(dòng)物體內(nèi)腸液相差甚遠(yuǎn)，它們無(wú)法解決模擬消化液消化能力的重現(xiàn)性問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了根據(jù)與鴨體內(nèi)腸液中4種主要消化酶的活性相等的原則，通過(guò)4種試劑酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)制備模擬鴨腸液［4］。這種方法制備的模擬鴨腸液與對(duì)應(yīng)體內(nèi)腸液的消化能力雖然還有一定差距［6］，但在模擬鴨腸液消化能力的重現(xiàn)性上，具有較好的重復(fù)性［13］。為了進(jìn)一步提高模擬鴨腸液的仿真程度，本實(shí)驗(yàn)室研究了以鴨腸液酶粉劑為基礎(chǔ)，通過(guò)加入少量試劑酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)制備的模擬鴨腸液與體內(nèi)腸液的酶學(xué)特性非常接近［6］。在該方法中，鴨腸液酶粉劑與試劑酶各自貢獻(xiàn)的消化酶活性占模擬鴨腸液消化酶總活性的比例在哪個(gè)范圍內(nèi)不會(huì)影響模擬消化液的消化能力是今后模擬鴨腸液制備規(guī)范的一個(gè)重要參數(shù)。從本試驗(yàn)的結(jié)果看，鴨腸液酶粉劑與試劑酶對(duì)模擬鴨腸液中消化酶總活性(以蛋白酶為基礎(chǔ))的貢獻(xiàn)在25%和75%，50%和50%時(shí)，2種模擬鴨腸液對(duì)同一飼料原料的干物質(zhì)真消化率和酶水解物真能值的差異均在0.88%、0.17 MJ/kg以?xún)?nèi)，這一差異處于SDS－2測(cè)試的系統(tǒng)誤差范圍之內(nèi)［12］。而這2種模擬鴨腸液比75%和25%處理的模擬鴨腸液對(duì)飼料原料的干物質(zhì)真消化率和酶水解物真能值分別高0.45%、0.67 MJ/kg。根據(jù)3個(gè)模擬鴨腸液的消化酶干物質(zhì)殘留量及對(duì)飼料原料的表觀消化率的變化規(guī)律可以得出，75%和25%處理與其他2個(gè)處理的模擬鴨腸液對(duì)飼料原料的消化能力稍低可能與仿生消化中消化酶干物質(zhì)殘留的干擾有關(guān)。綜合上述結(jié)果，鴨腸液酶粉劑對(duì)模擬鴨腸液中消化酶總活性的貢獻(xiàn)在25%～50%就可以達(dá)到較好的模擬效果。與此同時(shí)也說(shuō)明，鴨腸液酶粉劑還需要進(jìn)一步純化，以降低雜質(zhì)對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾。

4 結(jié)論

①在模擬鴨腸液中，不同批次來(lái)源的鴨腸液酶粉劑對(duì)玉米、豆粕、小麥麩干物質(zhì)消化率與酶水解物能值無(wú)顯著性差異。

②在模擬鴨腸液內(nèi)，鴨腸液酶粉劑對(duì)模擬鴨腸液中消化酶總活性的貢獻(xiàn)在25%～50%時(shí)消化能力相對(duì)穩(wěn)定。

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