趙宏麗 孫海洲 李金霞 趙存發(fā) 桑 丹 李勝利 張春華

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，呼和浩特 010031;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，呼和浩特 010018;3.海拉爾農(nóng)墾集團(tuán)特泥河分公司，海拉爾 021024)

提高動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)的利用率是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)者的主要目標(biāo)之一。蛋白質(zhì)利用率的提高不僅意味著可以降低飼養(yǎng)成本，而且可以減少碳氮排放起到保護(hù)環(huán)境的作用。與單胃動(dòng)物相比，反芻動(dòng)物氮的利用率只有20% ～30%，具有很大的提高潛力，因此提高反芻動(dòng)物氮的利用率一直是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究者的重任之一。腸道作為氨基酸及蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的最終場(chǎng)所，起到調(diào)節(jié)氨基酸進(jìn)入門(mén)脈循環(huán)及血液的形式的作用［1］，其結(jié)構(gòu)的完整性以及功能的正常發(fā)揮對(duì)氨基酸代謝起著關(guān)鍵的作用［2］。與外周組織相比，腸道蛋白質(zhì)合成占機(jī)體9% ～12%［3］。腸道不僅是機(jī)體重要的消化代謝吸收器官，也是很重要的免疫器官和防護(hù)屏障，參與機(jī)體的特異性免疫和非特異性免疫［4－5］，同時(shí)其緊密連接的連續(xù)的單層上皮細(xì)胞構(gòu)成一道隔離外界復(fù)雜環(huán)境的物理屏障［6］。

隨著對(duì)氨基酸功能研究的不斷深入，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物和單胃動(dòng)物上研究發(fā)現(xiàn)，功能性氨基酸精氨酸(Arg)和亮氨酸作為腸上皮細(xì)胞哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路的有效調(diào)節(jié)因子，可以促使腸道蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，從而促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖生長(zhǎng)［7］。特別是Arg不僅參與蛋白質(zhì)的合成，而且也是一氧化氮(NO)、尿素、多胺、鳥(niǎo)氨酸、脯氨酸、肌酸、谷氨酸鹽和胍丁胺等重要生理活性物合成的主要前體物。其中NO在調(diào)節(jié)腸道的血流量及內(nèi)分泌，維持腸道完整性和腸細(xì)胞遷移方面均發(fā)揮著重要的作用［8］。目前關(guān)于Arg對(duì)腸道生理功能方面的研究主要集中在單胃動(dòng)物豬、雞和嚙齒類(lèi)動(dòng)物鼠上，已有報(bào)道指出Arg具有調(diào)節(jié)腸道及機(jī)體免疫力的功能［9－10］，因此對(duì)腸道損傷也具有一定的治療作用［11］。關(guān)于Arg的中間代謝產(chǎn)物N－乙酰谷氨酸(NAG)的類(lèi)似物N－氨甲酰谷氨酸(NCG)，目前在單胃動(dòng)物仔豬上有報(bào)道表明，基礎(chǔ)飼糧中添加0.08%的NCG可以提高日增重以及空腸、十二指腸、回腸的絨毛高度和隱窩深度，進(jìn)而提高了腸道重量，同時(shí)提高了空腸和十二指腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量［12］。關(guān)于Arg及NCG在幼齡反芻動(dòng)物上面的作用，李金霞［13］在2010年通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)在飼糧中添加瘤胃保護(hù)性Arg及NCG進(jìn)行了相關(guān)的研究。本試驗(yàn)采用一次性大劑量灌注L－苯丙氨酸來(lái)研究瘤胃保護(hù)性Arg及NCG對(duì)羔羊腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用15只體況良好，平均體重為(25.00±3.39)kg的5月齡半同胞羯鄂爾多斯細(xì)毛羊，按體重隨機(jī)分為5組，每組3只。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧配制參照NRC(2007)綿羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平參見(jiàn)表1。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(1組)，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.15 g/d NCG(2組)、0.20 g/d NCG(3組)、1.50 g/d Arg(4組)和 2.00 g/d Arg(5組)的試驗(yàn)飼糧。Arg及NCG分別購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司和北京菲迪飼料科技有限責(zé)任公司。關(guān)于瘤胃保護(hù)性Arg和NCG的制備及穩(wěn)定性檢測(cè)參見(jiàn)李金霞［13］的方法。

1.3 飼養(yǎng)管理

試羊空腹稱(chēng)重后，安裝集糞袋、集尿袋，放入代謝籠飼養(yǎng)，每日在06:00和18:00分別先粗后精等量飼喂2次，自由飲水。每日準(zhǔn)確記錄試驗(yàn)羊的采食量和剩草料量，預(yù)試期為15 d，正試期為45 d。

1.4 試驗(yàn)方法

每組分別選取1只羔羊，采用大劑量一次灌注法，測(cè)定腸道黏膜的蛋白質(zhì)合成率。1.4.1 灌注液的制備

灌注劑量:按每千克代謝體重(kg W0.75)灌注0.2 g L－苯丙氨酸(其中含99%L－苯丙氨酸－D5，Cambridge Isotope Laboratory，美國(guó))。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(DM basis)

1)每千克預(yù)混料含有One kilogram of premix contained the following:VA 600 000IU，VD3120 000IU，VE 2 400 mg，F(xiàn)e 9 000 mg，Cu 1 500 mg，Zn 9 000 mg，Mn 4 000 mg，I 90 mg。

2)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、鈣、磷、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維為測(cè)定值，其他營(yíng)養(yǎng)水平均為計(jì)算值。DM，CP，Ca，P，NDF and ADF were measured values，while the other nutrient levels were calculated values.

將所有羊只用的L－苯丙氨酸一次稱(chēng)好，按每只羊150 mL生理鹽水溶解。用0.2 μm的濾膜過(guò)濾溶液，用真空泵或水泵可加速過(guò)濾。溶液高壓滅菌15 min。高壓滅菌后的溶液可置于室溫過(guò)夜。在灌注的當(dāng)天，將灌注液稍稍加熱至約40℃，然后將灌注液吸入50 mL無(wú)菌注射器中，并放在40℃的培養(yǎng)箱內(nèi)準(zhǔn)備灌注。平均每只羊灌注150 mL灌注液。

1.4.2 頸靜脈血插管的安裝

于灌注L－苯丙氨酸前30 min在2側(cè)頸靜脈插入靜脈滯留針，接上三通，其中一側(cè)三通的另一側(cè)接上靜脈延長(zhǎng)管，用于L－苯丙氨酸的灌注;另一個(gè)直接用于血液樣本的采集。

1.4.3 灌注和采樣

原因：鈣劑作為骨骼重建所需要的一種原材料，當(dāng)將其補(bǔ)充入體內(nèi)后，首先需要人體能夠?qū)⑵湮绽?，而維生素D 或活性維生素D恰恰可以起到促進(jìn)鈣吸收的作用。

將試驗(yàn)羊于第16天08:00開(kāi)始灌注L－苯丙氨酸，進(jìn)行蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的測(cè)定。

灌注前在預(yù)先刮好的皮膚上用普魯卡因進(jìn)行局部麻醉，用直徑1 cm的環(huán)鉆在該區(qū)域的后底緣采取2個(gè)皮膚組織樣品，用作組織的本底樣品(t0)。采下的樣品用冰生理鹽水沖洗，液氮冷凍，－80℃冷藏保存。

通過(guò)一側(cè)頸靜脈插管將L－苯丙氨酸灌注液緩慢注入，10 min內(nèi)注完。注完后，用生理鹽水沖洗插管。不能用該插管采集任何血液樣品。

灌注前，從另一側(cè)頸靜脈插管采取血液樣品作為0時(shí)間點(diǎn)樣品。灌注開(kāi)始后，分別在5(灌注中)、10(灌注后)、20、40、60、90 min 采取血樣，每次采血5～10 mL。置于冰中保存，然后在4℃條件下2 000×g離心15 min，血漿樣品 －20℃保存，供同位素苯丙氨酸分析。采完血樣后，要用肝素－生理鹽水沖血插管。

灌注90 min后，再用戊巴比妥鈉麻醉，之后屠宰，防止腸道細(xì)胞死亡形成腐肉。

迅速放血屠宰。切開(kāi)腹腔取出全部小腸，迅速置入含有雙抗的冰凍磷酸鹽緩沖液(PBS)中。剪開(kāi)腸系膜，將腸段打開(kāi)，將各腸斷剪成5 cm的小段，將部分空腸和十二指腸剖開(kāi)腸管，冰凍PBS沖洗干凈后，用定性濾紙將黏膜表面的PBS吸干，用載玻片將腸黏膜輕輕地刮下來(lái)，分裝后液氮保存，待測(cè)。準(zhǔn)確記錄組織樣品的采樣時(shí)間。

1.5 分析方法

1.5.1 血漿樣品及組織樣品的前處理

方法參考 Garlick 等［14］。

方法參考 Liu 等［15］。

1.6 計(jì)算方法

血漿游離氨基酸中示蹤苯丙氨酸豐度(MPEp)等于采樣期內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)血漿示蹤苯丙氨酸豐度的加權(quán)平均值，公式如下:

MPEp=5×(MPE0+MPE5)/2+5×

(MPE5+MPE10)/2+10×(MPE10+

MPE20)/2+20×(MPE20+MPE40)/2+20×

(MPE40+MPE60)/2+30×(MPE60+

MPE90)/2－MPE0。

式中:MPE0、…、MPE90 分別為 0、…、90 min的血漿游離氨基酸中示蹤苯丙氨酸豐度。

組織蛋白質(zhì)合成率根據(jù)Lobley等［16］的公式計(jì)算。

蛋白質(zhì)合成

式中:MPEt0和 MPEt分別為0(本底值)和90 min組織中蛋白質(zhì)結(jié)合的示蹤苯丙氨酸豐度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS 9.0軟件包中的ANOVA過(guò)程進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

由表2所示的各組蛋白質(zhì)合成率來(lái)看，各試驗(yàn)組的空腸黏膜和十二指腸黏膜的蛋白質(zhì)合成率與對(duì)照組比較差異均顯著(P＜0.05)。

對(duì)于空腸黏膜，各組的蛋白質(zhì)合成率依次為:4組＞3組＞5組＞2組＞1組，與1組相比，4組、3組、5組和2組的空腸黏膜蛋白質(zhì)合成率分別顯著提高了 38.41%、31.37%、29.27%、17.48%(P＜0.05)，其中4組與其他各試驗(yàn)組差異顯著(P＜0.05)，但3組與5組差異不顯著(P＞0.05)。

十二指腸黏膜蛋白質(zhì)合成率依次為:4組＞5組 ＞3組 ＞2組 ＞1組，與1組相比，4組、5組、3組和2組的十二指腸黏膜的蛋白質(zhì)合成率分別顯著提高了 35.18%、12.39%、9.51%、和 6.62%(P＜0.05)，4組與其他各試驗(yàn)組差異顯著(P＜0.05)，3組與5組差異不顯著(P＞0.05)，與空腸黏膜結(jié)果相一致，但2組與3組差異不顯著(P＞0.05)。

綜合空腸黏膜和十二指腸黏膜的試驗(yàn)結(jié)果得出，3組、4組與5組對(duì)腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率提高幅度較大，其中以4組提高幅度最大，效果最好。

表2 瘤胃保護(hù)性Arg及NCG對(duì)細(xì)毛羊小腸黏膜蛋白質(zhì)合成速率的影響Table 2 Effects of rumen protected arginine and N－carbamylglutamic acid on synthesis rate of protein in small intestinal mucosa of fine－wool sheep %/d

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P＞0.05)。

In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference(P ＜0.05)，while with the same small letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).

3 討論

小腸作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的首要器官，對(duì)飼糧蛋白質(zhì)和氨基酸的消化、吸收、代謝均起著重要的作用。有研究表明小腸是人和動(dòng)物氨基酸代謝的主要場(chǎng)所，飼糧中30% ～50%的必需氨基酸首先被腸道所代謝［2］，其每天的蛋白質(zhì)合成率是周緣組織的數(shù)倍［17－18］。因此研究腸道對(duì)氨基酸不同代謝途徑對(duì)于掌握機(jī)體氨基酸的利用率和蛋白質(zhì)的需要量有著重要的意義。

表3涵蓋了1987年至2007年應(yīng)用穩(wěn)定性同位素試驗(yàn)法得出的豬、雞、牛和羊的腸道蛋白質(zhì)合成率。這些究結(jié)果均表明，與外周組織相比，腸道的蛋白質(zhì)合成率較高。本試驗(yàn)在5月齡羯鄂爾多斯細(xì)毛羊羔羊的基礎(chǔ)飼糧中添加瘤胃保護(hù)性Arg及NCG得到的腸黏膜蛋白質(zhì)合成率處于50%～90%。

表3 畜禽腸道蛋白質(zhì)合成率Table 3 Intestinal protein synthesis rate in livestock and poultry

腸道作為聯(lián)系機(jī)體第1基因組(機(jī)體本身的基因組)與第2基因組(微生物基因組)的紐帶，對(duì)于成年動(dòng)物是Arg內(nèi)源合成很關(guān)鍵的場(chǎng)所之一。存在于腸道的NAG合成酶和二氫化吡咯－5羧化酶(P5C)可以合成Arg的前體物瓜氨酸，瓜氨酸進(jìn)入腎臟以后在精氨基琥珀酸合酶和裂解酶的催化下進(jìn)一步合成機(jī)體所需的Arg［28－29］。但對(duì)于幼齡動(dòng)物，Wu等［30］于2004年在仔豬上的報(bào)道指出，仔豬出生1～7日齡時(shí)，腸道的Arg琥珀酸合酶和裂解酶活性很高，瓜氨酸可以局部合成Arg來(lái)滿足其生長(zhǎng)需要，但14～21日齡時(shí)，腸道內(nèi)2個(gè)關(guān)鍵性的酶活降低，Arg的內(nèi)源合成受限必須通過(guò)飼糧供給得以滿足。此外甄玉國(guó)等［31］在反芻動(dòng)物絨山羊上發(fā)現(xiàn)小腸可吸收氨基酸的供應(yīng)對(duì)組織蛋白質(zhì)有著顯著的影響作用，而反芻動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的利用有限，因此在飼糧中添加一些具有調(diào)節(jié)腸道功能的氨基酸具有一定的生理意義。而功能性氨基酸Arg與谷氨酰胺一樣對(duì)腸道功能具有調(diào)節(jié)作用［32－33］。

本試驗(yàn)在羔羊飼糧中添加瘤胃保護(hù)性Arg及NAG的類(lèi)似物NCG來(lái)探究其對(duì)反芻動(dòng)物腸道蛋白質(zhì)合成能力的作用，得到了較為理想的試驗(yàn)結(jié)果，為開(kāi)拓Arg在反芻動(dòng)物方面的應(yīng)用提供參考。試驗(yàn)中采用的一次性大劑量灌注同位素示蹤法克服了連續(xù)性灌注同位素法的游離氨基酸難以標(biāo)記的缺陷以及傳統(tǒng)氮代謝試驗(yàn)的不精確性。關(guān)于該法的優(yōu)勢(shì)和實(shí)用性Garlick等［14］在1980年進(jìn)行了詳盡的報(bào)道。

4 結(jié)論

添加瘤胃保護(hù)性Arg及NCG對(duì)腸道黏膜蛋白質(zhì)合成率具有提高作用，分別以1.50 g/d Arg和0.20 g/d NCG 2個(gè)劑量較好。

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