邢愛英 劉忠泉 劉洋 賈紅彥 李自慧 鄭曉靜 曹廷明 杜鳳嬌 杜博平 古淑香 張宗德

近幾年來，全球TB患者有不斷增加的趨勢，我國TB發(fā)病率居世界第二。耐藥結(jié)核病、流動人口罹患TB、Mtb和HIV的雙重感染者的增加以及BCG對成年人保護(hù)作用的不佳（0%～70%）［1］使得我國結(jié)核病的預(yù)防控制工作進(jìn)一步加劇。結(jié)核疫苗的研制一直是結(jié)核預(yù)防控制工作方面的一大主要措施。筆者在克隆、表達(dá)復(fù)蘇因子（resuscitation－promoting factor，Rpf）蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用5個復(fù)蘇因子蛋白質(zhì)疫苗免疫BALB／c小鼠后，用Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染BALB／c小鼠，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇因子D、E有很高的免疫原性［2－3］。因此，筆者構(gòu)建了 Mtb Rpf D、Rpf E－DNA疫苗，探討 Rpf D及 Rpf E－DNA疫苗對感染Mtb的BALB／c小鼠的免疫特性。

材料和方法

一、材料

SPF級BALB／c型小鼠（4周齡）購至自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株為本室保存；Glas－col吸入暴露系統(tǒng)為 Glas－col公司產(chǎn)品；佐劑陽離子聚合物購自廈門太陽馬生物工程有限公司；IFN－γ、IL－2、IL－12 檢測試劑盒購自美國R＆D公司；淋巴細(xì)胞增殖試劑（Cell Counting Kit CCK－8）購自美國羅氏公司；非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司；兔抗小鼠抗血清抗體購自Sigma公司；His Bind Purification Kit（融合標(biāo)簽蛋白純化試劑盒）購自美國Novagen公司。

二、方法

1．Rpf D、Rpf E－DNA質(zhì)粒疫苗的構(gòu)建和表達(dá)：具體方法參考文獻(xiàn)［4］。

2．轉(zhuǎn)染質(zhì)粒制備：按照梭華Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書制備。

3．免疫動物：180只SPF級4周齡BALB／c雌性小鼠，平均分為6組。即空質(zhì)粒組、Rpf D質(zhì)粒組、Rpf E質(zhì)粒組、BCG組、生理鹽水組、空白對照組?？召|(zhì)粒組、Rpf D質(zhì)粒組、Rpf E質(zhì)粒組和生理鹽水組分別背部皮下接種空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、Rpf D－DNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、Rpf E－DNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、生理鹽水各200μl；而空白對照組不免疫。BCG組在各組第3次免疫時進(jìn)行BCG免疫（每只免疫BCG 105CFU），3周后第2次免疫；再過3周第3次免疫。

4．感染動物：第3次免疫后的第4周，用含吐溫80的7H9液體培養(yǎng)基（自配）復(fù)蘇培養(yǎng)H37Rv并以PBS稀釋至5×107CFU，分別取10ml霧化感染各組小鼠。

5．淋巴細(xì)胞的制備：在感染后第8周各組采用直接抽選法隨機抽取24只小鼠，眼球取血1．0ml和取脾臟及全肺。血液分離血清備用，脾臟用分子篩分離淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分層液純化淋巴細(xì)胞，加入防凍液液氮中保存。全肺取少許組織進(jìn)行病理檢查，余下的組織10倍等比稀釋，各取100μl涂于7H11平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行菌負(fù)荷實驗。每組余6只觀察生存狀態(tài)。

6．血清的免疫學(xué)試驗：血清按ELISA方法分別檢測血清中抗IgG抗體和IFN－γ［5］。

7．淋巴細(xì)胞增殖試驗（lymphocyte proliferation test）：復(fù)蘇淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／ml，取48孔板，加300μl含兩性霉素B（終濃度為1mg／L）的1640培養(yǎng)基和100μl淋巴細(xì)胞，并設(shè)不加細(xì)胞的空白對照孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，加入10μl（800μg／ml）復(fù)蘇因子D或E，并設(shè)不加復(fù)蘇因子蛋白質(zhì)的陰性對照和加入1μl（1000μg／ml）刀豆球蛋白A（Concanavalin A，Con A）作為陽性對照。3d后取300μl上清ELISA方法檢測IFN－γ和IL－12，IL－2，細(xì)胞培養(yǎng)板加入10μl CCK－8，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h時，450nm測A值。淋巴細(xì)胞增殖率（SI）＝刺激孔A值／對照孔A值×100%。

8．CTL殺傷效應(yīng)實驗（CTL killing activity）：復(fù)蘇小鼠脾淋巴細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／ml，采用美國Promega公司生產(chǎn)的非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒（LDH法）檢測。

9．組織病理分析：肺組織作病理切片，進(jìn)行HE染色［6］。

10．小鼠肺組織CFU計數(shù)，上述7H11平板培養(yǎng)第20和30天分別計數(shù)細(xì)菌菌落。

11．統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 11．5軟件分別對疫苗免疫組（RpfD、RpfE）與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組進(jìn)行F檢驗。

結(jié) 果

1．組織病理形態(tài)：空白對照組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組：肺顏色灰白，表面有大量粟粒性結(jié)核病灶（圖1）。RpfD質(zhì)粒組、Rpf E質(zhì)粒組、BCG組：肺顏色鮮紅，表面光滑，散在少量粟粒性結(jié)核病灶（圖2）。

2．血清抗體及IFN－γ檢測：Rpf D、E質(zhì)粒組血清抗體與其他各組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0．01）；Rpf D、E質(zhì)粒組IFN－γ與BCG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0．05）；Rpf D、E質(zhì)粒組IFN－γ與空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0．01）。Rpf抗體及IFN－γ在RpfD組與RpfE組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0．05）（表1）。

RpfD質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較，RpfD抗體F值分別為45．6，43．2，45．1，45．7，P值均＜0．01。IFN－γF值分別為10．2，15．6，17．8，17．3，RpfD 質(zhì)粒組與 BCG 組比較P＜0．05，與其余各組比較P值均＜0．01。RpfE質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較，RpfE抗體F值分別為51．5，53．6，51．0，52．2，P值均 ＜0．01。IFN－γF值分別為12．4，17．5，21．1，20．7，RpfE質(zhì)粒組與BCG組比較P＜0．05，與其余各組比較P值均＜0．01。

3．淋巴細(xì)胞增殖實驗及殺傷實驗：Rpf D、E質(zhì)粒組CCK－8與空質(zhì)粒組、BCG組、生理鹽水組、空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0．05）；Rpf D、E質(zhì)粒組殺傷實驗（LDH）與空質(zhì)粒組、BCG組、生理鹽水組、空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0．05）；CCK－8及LDH 在Rpf D組與Rpf E組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）（表2）。

RpfD質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較，CCK－8F值分別為9．5，10．1，10．0，9．0，P值均＜0．05。LDHF值分別為8．8，14．5，13．7，11．9，P值均＜0．05。RpfE 質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較，CCK－8F值分別為11．2，12．9，11．7，10．3，P值均＜0．05。LDHF值分別為8．1，12．5，11．6，11．1，P值均＜0．05。

RpfD質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較，IL－12F值分別為5．0，1．9，2．3，2．7，P值均＞0．05。IL－2F值分別為12．5，14．6，13．5，13．9，P值均＜0．05。IFN－γF值分別為7．8，12．6，8．7，8．3，P值均＜0．05。RpfE 質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較，IL－12F值分別為 3．3，1．7，1．5，1．3，P值均＞0．05。IL－2F值分別為12．0，13．6，13．1，13．2，P值均 ＜0．05。IFN－γF值分別為 11．3，16．4，14．7，14．2，P值均＜0．05。

5．肺病理檢測：Rpf D質(zhì)粒組、Rpf E質(zhì)粒組無明顯炎癥灶（圖3，4）；BCG組有少量小面積炎癥灶（圖5）；空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組有大量且面積大的炎癥灶（圖6～8）。

表1 小鼠血清 Rpf D、Rpf E抗體（A 值）和IFN－γ（pg／ml）檢測結(jié)果（±s）

表1 小鼠血清 Rpf D、Rpf E抗體（A 值）和IFN－γ（pg／ml）檢測結(jié)果（±s）

．04 0．03±0．01 IFN－γ（pg／ml） 43．9±24．8 45．9±21．0 21．0±11．0 7．9±4．9 4．7±2空質(zhì)粒組 生理鹽水組 空白對照組抭體（A值） 0．32±0．1 0．39±0．1 0．02±0．01 0．01±0．0 0．09±0 RpfD質(zhì)粒組 RpfE質(zhì)粒組 BCG組．12 5．8±4．7

表2 細(xì)胞免疫原性檢測結(jié)果［SI／CTL，（±s）%］

表2 細(xì)胞免疫原性檢測結(jié)果［SI／CTL，（±s）%］

SI／CTL（%） Rpf D質(zhì)粒組 Rpf E質(zhì)粒組 BCG．0±8．4 116．0±2．2 LDH（CTL） 32．0±3．2 30．0±4．2 16．0±5．9 3．3±1．5 6．7±0．5 7質(zhì)粒組 空質(zhì)粒組 生理鹽水組 空白對照組CCK－8（SI） 176．0±4．2 183．0±4．3 101．0±1．1 100．0±6．8 104．3±3．5

表3 淋巴細(xì)胞增殖上清IL－12、IL－2和IFN－γ檢測結(jié)果［（±s）pg／ml］

表3 淋巴細(xì)胞增殖上清IL－12、IL－2和IFN－γ檢測結(jié)果［（±s）pg／ml］

．2 20．0±17．2 25．0±15．3 IL－2 9．5±2．4 9．2±1．2 2．4±2．1 1．2±0．3 1．8±1．0 1．5±0．7 IFN－γ 22．2±5．7 28．7±14．4 16．1±10．1 9．8±1．6 13．2±2空質(zhì)粒組 生理鹽水組 空白對照組IL－12 21．0±15．2 23．0±14．2 27．0±17．8 22．5±20 Rpf D質(zhì)粒組 Rpf E質(zhì)粒組 BCG組．1 15．7±2．9

圖3 Rpf D質(zhì)粒組HE×10；無明顯炎癥灶，無滲出，肺組織完整。圖4 Rpf E質(zhì)粒組HE×10；無明顯炎癥灶，無滲出，肺組織完整。圖5 BCG組HE×10；少量、分散、小面積炎癥灶，滲出少，肺組織完整。圖6 空質(zhì)粒組HE×10；大量、大面積炎癥灶，切片顯微鏡下有大量滲出物，2／3肺組織細(xì)胞破壞。圖7 生理鹽水組HE×10；大量、大面積炎癥灶，切片顯微鏡下有大量滲出物，2／3肺組織細(xì)胞破壞。圖8 空白對照組 HE×10；大量、大面積炎癥灶，切片顯微鏡下有大量滲出物，2／3肺組織細(xì)胞破壞

6．肺菌負(fù)荷量（CFU）計數(shù)結(jié)果：Rpf D質(zhì)粒組與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組和空白對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為22．3，40．2，35．8，28．7，P值均＜0．01）；Rpf E質(zhì)粒組與 BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組和空白對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為19．5，36．7，32．8，30．0，P值均＜0．01）（圖9）。

圖9 肺CFU計數(shù)直方圖（各24只小鼠，CFU為平均數(shù)）

7．小鼠生存質(zhì)量實驗：各組的6只小鼠觀察結(jié)果表明：對照組、生理鹽水組、空質(zhì)粒組在感染Mtb 3個月后出現(xiàn)行動緩慢、精神狀態(tài)差、毛色無油脂、體質(zhì)量減輕等癥狀。RpfD質(zhì)粒組、RpfE質(zhì)粒組、BCG組各方面與感染前沒有太大變化。

討 論

估計全球約1／3人口為Mtb潛伏感染者，其中約有5%～10%的人會在一生中的某個時間發(fā)展為活動性結(jié)核?。?］。新發(fā)TB患者主要來源于潛伏Mtb感染者，原因在于休眠 Mtb的再激活和復(fù)蘇［8－9］。Bigger［10］指出休眠菌是一組休眠的、非復(fù)制的、對抗菌藥物感覺遲鈍的持留菌。因此對于結(jié)核病的控制，提高結(jié)核疫苗的預(yù)防保護(hù)效果勢在必行，傳統(tǒng)結(jié)核疫苗BCG的保護(hù)效率不佳，對Mtb再感染沒有免疫保護(hù)作用［11］。Mtb復(fù)蘇因子是與Mtb復(fù)蘇有關(guān)的因子，一般認(rèn)為復(fù)蘇因子蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫效應(yīng)在感知正在復(fù)蘇的休眠M(jìn)tb中起著重要作用，同時復(fù)蘇因子蛋白質(zhì)也可能在正在復(fù)蘇的休眠M(jìn)tb的宿主免疫調(diào)控中起著重要作用［12］。

筆者選擇陽離子聚合物為佐劑與Rpf D、E質(zhì)粒混勻構(gòu)建DNA疫苗免疫小鼠3次，用H37Rv霧化感染小鼠，4周后處死小鼠檢測感染小鼠免疫學(xué)指標(biāo)及病理檢測、細(xì)菌負(fù)荷計數(shù)等辦法研究復(fù)蘇因子疫苗的免疫保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，從肺外觀察空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組小鼠肺有大量的粟粒狀結(jié)核病灶，且肺外觀顏色灰白。而BCG和復(fù)蘇因子D、E質(zhì)粒組小鼠肺粟粒狀結(jié)核病灶明顯減少，特別是Rpf D、E兩組，且顏色較為紅潤，表面光滑。小鼠肺組織CFU計數(shù)也表明空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組、BCG組肺菌負(fù)荷量在105級，而Rpf D、E質(zhì)粒組肺菌負(fù)荷量只在104級，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），表明 Rpf D、E－DNA疫苗在抑制感染小鼠Mtb生長方面有明顯的作用，BCG組有一定的抑菌作用。病理檢測發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇因子免疫組和BCG免疫組為組織輕度炎癥，而空質(zhì)粒組、生理鹽水組、對照組為組織中或重度炎癥。Yeremeev等［1］報道復(fù)蘇因子蛋白質(zhì)疫苗在接種大劑量的毒力Mtb H37Rv小鼠中表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，在小鼠肺臟和脾臟中Mtb的繁殖和生存時間都受到抑制，與本研究的結(jié)果一致。

感染免疫小鼠血清復(fù)蘇因子抗體及IFN－γ的檢測表明：Rpf D、E質(zhì)粒組抗體水平明顯高于BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組（P＜0．001）。Rpf D、E質(zhì)粒組IFN－γ表達(dá)水平與空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001），與BCG疫苗組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。表明Rpf D、E質(zhì)粒在感染小鼠體內(nèi)啟動了感染宿主的體液免疫。筆者在Rpf E－DNA疫苗對BALB／c小鼠免疫效應(yīng)研究的試驗中也得到了相應(yīng)的結(jié)果。Yeremeev等［1］報道Rpf蛋白質(zhì)疫苗在小鼠試驗中有很高的免疫反應(yīng)，除Rpf C外，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體IgG1和IgG2α、IFN－γ、IL－10、IL－12、促進(jìn) T細(xì)胞增殖，而不產(chǎn)生IL－4、IL－5。體液免疫和T細(xì)胞免疫顯現(xiàn)出高度的交叉反應(yīng)，與本研究的結(jié)果一致。

Romano等［13］的研究表明：對于 BABL／c小鼠，Rpf D、Rpf B能誘導(dǎo)結(jié)核感染小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN－γ和IL－2；Commandeur［12］認(rèn)為復(fù)蘇因子A和D能誘導(dǎo)有Mtb暴露的健康人群產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子，而對結(jié)核患者Rpf D能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子，Rpf A誘導(dǎo)不產(chǎn)生或產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子。Mtb感染疫苗免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖實驗（CCK－8）結(jié)果顯示：Rpf D、E質(zhì)粒組也有較高的淋巴細(xì)胞增殖率，與BCG組、空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。通過上清細(xì)胞因子水平檢測表明：IL－2、IFN－γ水平，RpfD、E質(zhì)粒組與BCG免疫比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與空質(zhì)粒組、生理鹽水組、空白對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001），而IL－12的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，并且都在低水平。本研究結(jié)果表明Rpf D、E疫苗能在感染小鼠體內(nèi)產(chǎn)生很好的T細(xì)胞免疫，與Romano等［13］和 Commandeur［12］報道中的 Rpf B、Rpf D 疫苗對機體能產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用一致。而Rpf D－DNA和Rpf E－DNA 疫苗結(jié)果各項指標(biāo)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明 Rpf D－DNA 和 Rpf E－DNA疫苗對感染小鼠有同等的免疫效果。

本研究結(jié)果表明，復(fù)蘇因子疫苗可增強Mtb感染小鼠的細(xì)胞免疫功能，并且能有效地減少肺組織菌負(fù)荷量，提高生存質(zhì)量。筆者擬進(jìn)一步建立小鼠潛伏感染模型并觀察預(yù)防結(jié)核病“復(fù)燃”的效果，以期從另一角度研究新型的結(jié)核病預(yù)防性疫苗。

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