蔣俊 張娟 張紅 賈琳 魏成翠 石蓮 馬靜紅 楊立軍

耐藥結(jié)核病尤其是MDR－TB和XDR－TB的治療已成為結(jié)核病控制工作中亟待解決的問題［1］。我國2007—2008全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告顯示，結(jié)核病耐多藥情況嚴(yán)重［2］。2010年胡遠(yuǎn)蓮等［3］的《我國二線抗結(jié)核藥物使用現(xiàn)狀調(diào)查研究》報告中顯示，我國二線抗結(jié)核藥物（second－line anti－tuberculosis drugs，SLD）在各級結(jié)核病防治機構(gòu)使用的很普遍，不同級別、不同類型的醫(yī)療機構(gòu)SLD的使用存在較大差異，而SLD的藥敏試驗開展的卻很少。這一現(xiàn)狀嚴(yán)重影響了MDR－TB患者的治療效果，甚至進(jìn)一步導(dǎo)致XDR－TB的發(fā)生。近年，MGIT960系統(tǒng)快速二線藥敏試驗倍受業(yè)內(nèi)人士關(guān)注。2011年1月，本室在前期完成 MGIT 960液體與羅氏（L?wenstein－Jensen medium，L－J）固體兩種方法結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定及一線抗結(jié)核藥物藥敏比對試驗的基礎(chǔ)上，以金標(biāo)準(zhǔn)L－J培養(yǎng)法為參照，以卷曲霉素 （capreomycin，Cm）、卡 那 霉 素 （kmamycin，Km）、氧氟沙星（ofloxacin，Ofx）和乙硫異煙胺（etoionamide，Eto）SLD為代表，對 MGIT 960系統(tǒng)SLD藥敏試驗的實用性進(jìn)行了評價。

材料和方法

一、患者標(biāo)本納入

根據(jù)衛(wèi)生部國際交流與合作中心《碧迪（Becton Dickinson，BD）結(jié)核病控制項目遼寧工作方案》（簡稱：《方案》）的要求，本實驗患者嚴(yán)格按照文獻(xiàn)［4］選擇，在臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查確診，或高度疑似的沈陽市胸科醫(yī)院初始入院（未經(jīng)抗結(jié)核治療）的肺結(jié)核患者中進(jìn)行。2010年8月至2011年1月共納入上述《方案》要求的患者435例，其中男性319例，女性116例，平均年齡（52．3±17．2）歲（10～86歲），并分別留取該納入患者經(jīng)檢驗人員目視檢查合格的痰液（晨痰）標(biāo)本435例，其中的非合格標(biāo)本均是經(jīng)過進(jìn)一步指導(dǎo)后重新留取送檢的標(biāo)本［5］。

二、實驗材料和培養(yǎng)基

1．實驗儀器 ：全自動BACTEC MGITTM960 TB系統(tǒng)（美國BD公司）。

2．MGIT960液體培養(yǎng)基 ：MGIT 960液體培養(yǎng)基（批號：0044761）；MGIT生長添加劑（growth supplement）（批號：0131176）；MGIT 雜菌抑制劑（PANTA）（批號：0083257）均購置于美國BD公司。

3．L－J固體培養(yǎng)基：L－J固體培養(yǎng)基依據(jù)《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［5］由本室制備。

4．二線藥敏質(zhì)控菌株：（1）10株（1－10依次編號：FJ09094、FJ09094、FJ09094、FJ09094、FJ09094、FJ09094、FJ09094、FJ09094、FJ09094、H37Rv）國家結(jié)核病參比實驗室提供（菌株庫－80℃凍存品）；（2）大腸埃希菌（ATCC25922）株，購置于上海生物制品鑒定所。

三、耐藥培養(yǎng)基的制備

（一）實驗藥品

1．一線抗結(jié)核藥敏藥物：異煙肼（INH）、利福平（RFP）、鏈霉素（S）和乙胺丁醇（EMB），為中國CDC傳染病預(yù)防控制所提供的美國Sigma公司試劑盒（批號：0047060）。

2．二線抗結(jié)核藥敏藥物：卷曲霉素（批號：029k0266）、卡那霉素（批號：0001440547）、氧氟沙星（批號：040M1313）和乙硫異煙胺（批號：139811010509116），為中國CDC傳染病預(yù)防控制所提供的美國Sigma公司產(chǎn)品。

3．分枝桿菌菌種鑒定品：對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩－2－羧酸肼（TCH），為遼寧省CDC結(jié)核病防治所提供的美國Sigma公司產(chǎn)品。

（二）耐藥培養(yǎng)基制備

MGIT 960耐藥培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)［6］制備，其終濃度見表1；L－J耐藥培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)［5］制備，其終濃度見表1。

表1 SLD加入MGIT 960和L－J培養(yǎng)基內(nèi)的含藥濃度（μg／ml）

四、二線藥敏質(zhì)量控制

1．室間質(zhì)控：MGIT 960系統(tǒng)與 L－J培養(yǎng)法SLD藥敏比對試驗前，L－J培養(yǎng)法Cm、Km、Ofx和Eto 4種SLD藥敏試驗，經(jīng)過國家結(jié)核病參比室統(tǒng)一下發(fā)的10株質(zhì)控株（重復(fù)試驗3次）質(zhì)控。

2．質(zhì)控結(jié)果：質(zhì)控試驗結(jié)果符合率：Cm 90．0%（27／30），Km 93．3% （28／30），Ofx 100．0% （30／30），Eto 100．0% （30／30），符合率＞90%。

3．室內(nèi)質(zhì)控：每批次試驗均做質(zhì)控。以H37Rv（ATCC27294）株為陽性質(zhì)控；大腸埃希菌株為陰性質(zhì)控。

五、實驗方法

（一）陽性株篩查

對納入的435例患者痰液同一標(biāo)本分別進(jìn)行涂片抗酸染色（萋－尼法）鏡檢，改良羅氏固體培養(yǎng)和MGIT960系統(tǒng)液體培養(yǎng)進(jìn)行陽性菌株的篩查及菌群（菌種）鑒定。

1．抗酸染色鏡檢：（1）涂片：應(yīng)用折斷的竹簽茬端分若干批次分別挑取上述痰標(biāo)本的膿樣、干酪樣部分約0．05～0．1ml均勻涂抹玻片中央處約成10mm×20mm橢圓形痰膜，自然干燥。（2）染色：萋－尼法染色，100×油鏡鏡檢查找呈紅色的抗酸桿菌（AFB）。（3）結(jié)果判定：①連續(xù)觀察300個不同視野未發(fā)現(xiàn)AFB者為陰性。②發(fā)現(xiàn)AFB／300個視野者為陽性。分級報告以萋－尼染色鏡檢結(jié)果分級報告標(biāo)準(zhǔn)［4］加以表述（記錄）。

2．改良羅氏固體培養(yǎng)（L－J）：（1）前處理：取上述涂片后的痰標(biāo)本采用N－乙酰－L－半胱氨酸（NALC）－NaOH法進(jìn)行前處理。（2）接種培養(yǎng)：取前處理后的標(biāo)本分別接種至L－J和PNB培養(yǎng)基（含500mg／ml PNB的L－J培養(yǎng)基）各0．1ml，無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）結(jié)果判定及菌群鑒定：①L－J培養(yǎng)：接種并孵育后3d和7d各觀察1次菌落生長情況，4周內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌落生長并經(jīng)抗酸染色鏡檢證實可報告陽性。此后每周觀察1次，記錄菌落生長及污染情況，陰性結(jié)果在8周后未見菌落生長者方可報告；②PNB培養(yǎng)基：基于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）在PNB培養(yǎng)基中受抑制而不生長的特性，4周未見生長的菌株可判定為MTBC。（4）菌種鑒定：經(jīng)菌群鑒定為MTBC的菌株進(jìn)一步TGH生長試驗。①將 MTBC菌株（約含10－3MTBC）分別接種至 TCH 培養(yǎng)基（含5mg／ml TCH L－J培養(yǎng)基），置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；②基于TCH對牛結(jié)核分枝桿菌有抑制作用，而對大多數(shù)Mtb無抑制作用的特性，4周未見生長的菌株可判定為牛結(jié)核分枝桿菌。

3．MGIT960系統(tǒng)液體培養(yǎng)：①添加劑加入：嚴(yán)格地為每個MGIT960培養(yǎng)管添加0．8ml MGIT生長添加劑和PANTA；②接種培養(yǎng)：在MGIT培養(yǎng)管中加入0．5ml混合均勻的經(jīng)過前處理的痰液樣本置入MGIT960儀器中37℃培養(yǎng)；③結(jié)果報告：孵育至儀器報陽，最多培養(yǎng)6周，如未能生長儀器將標(biāo)記為陰性。

（二）一線藥物耐藥株篩查

將上述MGIT960和L－J陽性菌株分別進(jìn)行一線藥物INH、RFP、S和EMB的 MGIT 960系統(tǒng)和L－J培養(yǎng)法藥敏試驗，進(jìn)行耐藥菌株的篩查。篩查出的耐藥株作為本次SLD藥敏試驗的實驗菌株。

（三）二線藥物藥敏試驗

分別將一線藥敏耐藥菌株接種至含有適宜濃度（表1）的Cm、Km、Ofx和Eto SLD的 MGIT 960系統(tǒng)液體和L－J（比例法）固體培養(yǎng)基，同步進(jìn)行藥物敏感性試驗。MGIT 960液體培養(yǎng)儀器自動報告結(jié)果，L－J固體培養(yǎng)4周后報告結(jié)果［4］。

（四）結(jié)果判定

儀器提示MGIT960培養(yǎng)試驗完成并打印每種藥敏的藥敏試驗結(jié)果，定性為耐藥（R）、敏感（S）或不確定（×）；L－J培養(yǎng)藥敏依據(jù) WHO推薦的耐藥百分比＝（含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)／對照不含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)）×100%。＞1為耐藥（R），≤1為敏感（S），Cm、Km、Ofx和Eto采用同一標(biāo)準(zhǔn)［6］。

六、統(tǒng)計方法

MGIT960和L－J兩種培養(yǎng)方法的符合率（%）采用兩方法共同S和R例數(shù)之和與實驗標(biāo)本總例數(shù)之比進(jìn)行計算，其計算公式為：（S（ab）＋R（ab））／n×100%（S（ab）：MGIT 和 L－J兩 方 法 共 同 敏 感 數(shù)；R（ab）：MGIT和L－J兩方法共同耐藥數(shù)；n：實驗標(biāo)本總例數(shù)）。兩方法的差異性采用配對設(shè)計的卡方檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩種方法檢測結(jié)果的一致性的Kappa值計算應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16．0進(jìn)行判別，Kappa值≥0．75，說明兩種方法具有相當(dāng)滿意的一致性，0．75＞Kappa值≥0．4說明兩種方法的一致性一般滿意，Kappa值＜0．4說明兩種方法的一致性不理想。

結(jié) 果

一、痰涂片和L－J固體培養(yǎng)法與MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果

1．痰涂片、L－J和MGIT960培養(yǎng)法的陽性檢出率：435例標(biāo)本中痰涂片陽性206例，陰性229例，陽性檢出為47．4%（206／435）；MGIT960陽性245例，陰性168例，陽性檢出率為56．3%（245／435）；L－J培養(yǎng)陽性234例，陰性181例，陽性檢出率為53．8%（234／435）（表2）。

2．MGIT 960與L－J法陽性檢出率：上述435例標(biāo)本中去除單雙污染例數(shù)，實際有效標(biāo)本（樣本總例數(shù)減去單雙污染例數(shù)）為400例（435－35＝400），即實際納入兩者比對的標(biāo)本為400例，其中L－J和MGIT960培養(yǎng)法共同陽性219例，共同陰性156例（表3）。

二、陽性菌株篩查結(jié)果

MGIT960和L－J共同陽性標(biāo)本219例，經(jīng)PNB和TCH藥敏菌群（菌種）鑒定篩出結(jié)核分枝桿菌212例，去除2例生長不良株，210例結(jié)核分枝桿菌陽性株作為一線抗結(jié)核藥敏試驗株。

表2 痰涂片與MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)法和L－J固體培養(yǎng)法陽性檢出率比較

表3 MGIT 960與L－J法陽性檢出率比較（例）

三、一線藥物藥敏耐藥菌株篩查結(jié)果

210例陽性株經(jīng)一線藥敏試驗共篩出耐藥菌株118例。其中耐INH 102例，耐 RFP 85例，耐S 42例，耐 EMB 85例。

四、二線藥物藥敏試驗

MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)法與L－J培養(yǎng)法SLD藥敏試驗，SLD Cm、Km、Ofx和Eto敏感（S）及耐藥（R）符合率分別為，Cm 88．1%（104／118），χ2＝2．57，P＞0．05；Km 95．8% （113／118），χ2＝0．80，P＞0．05；Ofx 91．5%（108／118），χ2＝0．10，P＞0．05；Eto 71．2%（84／118），χ2＝28．26，P＜0．01（表4）。

五、培養(yǎng)時間

MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)法SLD藥敏試驗所需時間平均10．0d（1183／118），L－J培養(yǎng)法SLD藥敏試驗所需 時 間 平 均 28．5d（3 360／118），兩 者 相 差18．5d。

討 論

液體培養(yǎng)SLD敏感性試驗的應(yīng)用推廣一直受到人們的極大關(guān)注。自1996年BACTEC MGITTM960TB系統(tǒng)誕生以來，由于該系統(tǒng)的檢測功能與BACTEC 460系統(tǒng)相似，且無放射性污染，所以國內(nèi)外對MGIT 960系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)和藥敏試驗的實用性以及優(yōu)越性研究的較多［7－9］。

本研究結(jié)果顯示，現(xiàn)代MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)法與傳統(tǒng)L－J固體培養(yǎng)法二線抗結(jié)核藥物Km和Ofx結(jié)果的符合率較高（95．8%和91．5%，P值均＞0．05），經(jīng)一致性檢驗 Kappa值均＞0．75（0．815和0．824）其一致性為相當(dāng)滿意；Cm 的符合率為88．1%，P＞0．05，經(jīng)一致性檢驗0．75＜Kappa值＞0．4（0．520）其一致性為一般滿意。Eto符合率為71．2%，P＜0．01，經(jīng)一致性檢驗 Kappa值＜0．4（0．375），其一致性不理想。該結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)報道存在一定差異［8］，其原因可能與培養(yǎng)基藥物終濃度的不同有關(guān)：Eto在L－J固體培養(yǎng)基中的藥物終濃度為40μg／ml［5］，而在 MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)基中的藥物終濃度則為 5．0μg／ml［9］，可能是導(dǎo) 致 Eto MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)法耐藥比率高于L－J固體培養(yǎng)法的主要原因之一，此點有待進(jìn)一步研究加以驗證。從MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)與L－J固體培養(yǎng)法藥敏試驗檢測時間（培養(yǎng)周期）比較來看，MGIT 960培養(yǎng)的時間范圍為6～14d（平均10．0d），而L－J固體培養(yǎng)法為28．5d，前者比后者平均縮短了18．5d，突出體現(xiàn)了MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)的快速特點。另外，需要說明的是，雖然本研究比對的是臨床上較為常用的4種SLD，但該4種藥物僅是多種SLD中的部分藥物，所以這一實驗結(jié)果不能代表其他SLD。

表4 MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)法與L－J固體培養(yǎng)法結(jié)果與4種SLD藥敏試驗的符合率

結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗從固體培養(yǎng)到液體培養(yǎng)的過度，對于結(jié)核分枝桿菌檢測的快速報告和臨床治療方案的盡早制定具有十分重要意義。傳統(tǒng)的L－J固體培養(yǎng)雖然準(zhǔn)確率很高，但培養(yǎng)的時間過長，很大程度上制約了患者的及時診斷和科學(xué)治療。特別是痰檢陰性的結(jié)核患者，臨床上的治療往往由于缺乏診斷依據(jù)而帶來困難。經(jīng)驗用藥不僅會給患者帶來盲目的藥物負(fù)擔(dān)，而且極易引發(fā)MDR和（或）XDR的發(fā)生，給日后的治療增加難度。MGIT 960液體培養(yǎng)鑒定加藥敏試驗一般2～3周即可報告結(jié)果，大大縮短了臨床和患者獲取結(jié)果的等待時間，為臨床及時治療提供了便利，具有很強的實用性［10］，可作為結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)和藥敏試驗的新方法。隨著SLD敏感性試驗工作的逐步開展和實驗方法的不斷完善，MGIT 960系統(tǒng)的優(yōu)勢作用將會更多的顯現(xiàn)。

［1］唐神結(jié)，高文．臨床結(jié)核病學(xué)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：580－587．

［2］全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告．北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：49－52．

［3］胡遠(yuǎn)蓮，何廣學(xué)，劉志敏，等．我國二線抗結(jié)核藥物使用現(xiàn)狀調(diào)查研究．中國防癆雜志，2010，22（3）：123－128．

［4］中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)．WS288－2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008．

［5］中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會．結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程．北京：中國教育文化出版社，2006：54，56－57．

［6］World Health Organization．Policy guidance on drug－susceptibility testing（DOS）of second－line antituberculosis drugs．WHO／HTM／TB／2008．392．Geneva ：World Health Organization，2008．

［7］中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會．全國耐藥結(jié)核病學(xué)術(shù)研討會紀(jì)要．中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23（1）：78－81．

［8］趙麗麗，夏強，劉志廣，等．MGIT960和比例法對結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗的對比研究．醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40（5）：40－43．

［9］Alcaide F，Benítez MA，EscribàJM，et al．Evaluation of the BACEEC MGIT 960and the MB／BacT systems for recovery of mycobacteria from clinical specimens and for speciea identification by DNA Accuprobe．J Clin Microbiol．2000，38（1）：398－401．

［10］張娟，蔣俊，張紅，等．MGIT960與羅氏培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗中的比對分析．中國防癆雜志，2011，33（6）：361－364．