陳玉翠 周岳君 趙國強 田有坤

目前認(rèn)為，脂肪肝的發(fā)生與脂肪細(xì)胞因子相關(guān)性損害有關(guān)。脂肪組織是一個新的內(nèi)分泌器官，對全身各器官系統(tǒng)及脂肪組織本身有重要調(diào)節(jié)功能。它們通過誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡及脂肪細(xì)胞的分化，調(diào)控脂肪組織的量［1］。目前，對非酒精性脂肪肝(NAFL)發(fā)病機理的研究已深入到基因水平，有學(xué)者研究表明，非酒精性脂肪肝細(xì)胞色素 P450 1A1(CYP1A1)基因及表達(dá)變化［2］、肝細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)基因及表達(dá)變化、肝細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因中c2基因及表達(dá)變化［3］與非酒精性脂肪肝發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切。

脂易消為長期臨床實踐中總結(jié)出來的臨床效驗方，主要由枳殼、半夏、澤瀉、決明子、荷葉、鼠麹草等組成，有祛濕解毒、消痰散瘀、降脂抑脂之功效。長期臨床觀察和前期課題證實其療效確切［4］，為臨床治療脂肪肝的有效方藥。筆者現(xiàn)將脂易消對非酒精性脂肪肝CYP2E1基因表達(dá)的調(diào)控研究情況報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 將60只大鼠隨機分成6組，每組10只。(1)正常對照組。給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，灌服生理鹽水12 ml/kg，1次/d，共12周。(2)模型對照組。給予高脂飼料喂養(yǎng)，灌服生理鹽水12 ml/kg，1次/d，共12周。(3)低劑量治療組。給予高脂飼料喂養(yǎng)，灌服低劑量脂易消［相當(dāng)于生藥6 g/(kg·d)］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。(4)中劑量治療組。簡稱中劑量組，給予高脂飼料喂養(yǎng)，灌服中劑量脂易消［相當(dāng)于生藥12 g/(kg·d)］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。(5)高劑量治療組。給予高脂飼料喂養(yǎng)，灌服高劑量脂易消［相當(dāng)于生藥24 g/(kg·d)］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。(6)易善復(fù)對照組給予高脂飼料喂養(yǎng)，灌服易善復(fù)水溶液12 ml/kg［相當(dāng)于6.92 mg/(kg·d)］，1次/d，共12周。第12周周末晚禁食16 h后，次日上午將實驗大鼠以3%戊巴比妥鈉按0.15 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，先腹主動脈取血約4 ml，之后剪開胸腔，取出肝臟，迅速在4℃生理鹽水中沖洗后，于電子秤上秤重，然后在肝右葉中部切取數(shù)塊肝組織液氮速凍后保存于－80℃以提取總RNA，用于檢測肝細(xì)胞中CYP2E1 mRNA的表達(dá)。

1.2 技術(shù)方法 RT－PCR檢測CYP2E1 mRNA表達(dá)。(1)總RNA提取。從－70℃冰箱中取出300 mg肝組織，用液氮將組織研磨成粉末，并加入Trizo 12 ml研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的液體到無RNA酶和無DNA酶的1.5 ml離心管中。然后加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩混勻30 s后，室溫離心12 000 r/min×5 min;吸取上層水相溶液并轉(zhuǎn)移至另一新鮮的1.5 ml離心管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜止5 min，再次室溫離心12 000 r/min×5 min，棄上清，然后加入70%乙醇1 ml洗滌并干燥，最后用0.05 ml DEPC去離子水重新溶解RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外線分光光度計測定提取物的濃度，A260/A280比值在1.8～2.0之間。(2)合成相關(guān)引物。根據(jù)核苷酸序列用Primer premier 5.0設(shè)計引物，提交上海生物工程有限公司進(jìn)行合成，CYP2E1 mRNA引物序列如下:CYP2E1上游引物:5'－AGG GAG ACG CAG GTGT－3';下游引物:5'－CTG ATA CTG GTC GTA GGT GA －3'，擴增片段368 bp。內(nèi)參照β－actin上游引物:5'－ATG CCA TCC TGC GTC TG－3';下游引物:5'－ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACAT－3'，擴增片段578 bp。(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用上述細(xì)胞中提取的總RNA在下述反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，該反應(yīng)體系組成如下:5 × Buffer 5 μl、oligd(dT)10 pmol、dNTP(2.5 mM)4 μl、RNA 酶抑制劑 1 μl、M － MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 5 U。以DEPC水補齊至25 μl，輕輕混勻，室溫放置10 min后移入42℃恒溫槽中。42℃保溫1 h進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在冰水中冷卻2 min。所得到的反應(yīng)液即可用于PCR反應(yīng)中作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。(4)PCR反應(yīng)。取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物于50 μl反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體積組成如下:10 × Reaction Buffer 5 μl、4 種 dNTP 的混合物(每種 2.5 mM)2 μl、TaqDNA 多聚酶(3 μ/μl)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3 μl、上下游特異引物各1 μl、去離子水35 μl。先在94 ℃預(yù)變性 5 min，然后按下述條件循環(huán)30次，變性94℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，最后72℃延伸5 min。(5)PCR產(chǎn)物分析。PCR產(chǎn)物5 μl經(jīng)1%瓊脂糖(含溴化乙錠溶液0.5 μg/ml)凝膠電泳2 h，另取3 μl Marker作為DNA片段大小的對照。凝膠電泳后，應(yīng)用天能圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，用BandScan分析，測定產(chǎn)物條帶的吸光度值，以β－actin為基準(zhǔn)，做半定量分析，即CYP2E1 mRNA的相對表達(dá)水平以CYP2E1/β－actin值表示。

2 結(jié)果

采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT－PCR)法檢測肝組織CYP2E1 mRNA相對表達(dá)量。從肝組織CYP2E1相對表達(dá)量(V值)來看，模型組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達(dá)水平較正常組明顯增高(P＜0.01);脂易消各劑量組和易善復(fù)組顯著低于模型組(P＜0.01)，而各劑量組大鼠與易善復(fù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA相對表達(dá)量(V值)(±s)

表1 各組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA相對表達(dá)量(V值)(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

組別 例數(shù)CYP2E1 mRNA低劑量組 10 1.82±0.45△中劑量組 10 1.89±0.18△高劑量組 10 1.71±0.11△正常組 10 1.51±0.17模型組 10 3.69±0.46*易善復(fù)組 10 1.79±0.38△

3 結(jié)論

脂易消能明顯降低NAFL大鼠肝臟中CYP2E1 mRNA的表達(dá)細(xì)胞色素P450，是一組相對非特異性酶，廣泛存在于機體內(nèi)，但主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(微粒體)，負(fù)責(zé)外來物及某些體內(nèi)代謝物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，此酶可被某些化合物(包括藥物)誘導(dǎo)或抑制，影響化合物在體內(nèi)的代謝速度。在人的肝微粒體中，參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)(包括藥物和環(huán)境污染物)代謝的細(xì)胞色素P450主要有CYP lA2、2E1和3A，其中CYP 2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化許多前致癌物和前毒物的活化過程。人和大鼠的CYP 2E1是由單基因調(diào)控，并且所有CYP 2E1的底物在人和動物中都是相同的。本課題結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達(dá)水平較正常組明顯增高(P＜0.01);脂易消各劑量組和易善復(fù)組顯著低于模型組(P＜0.01)，而各劑量組大鼠與易善復(fù)組無明顯差異(P＞0.05)，表明脂易消能明顯降低NAFL大鼠肝臟中CYP2E1 mRNA的表達(dá)。脂易消能明顯降低NAFL大鼠肝臟中CYP2E1 mRNA的表達(dá)，可能是其防治非酒精性脂肪肝的重要作用機理之一。

［1］繆正秋．脂肪肝的防治［J］．寧波高等?？茖W(xué)校學(xué)報，1999，11(4):116．

［2］范建高，曾民德．脂肪肝的研究進(jìn)展［J］．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1999，8(2):149 －151．

［3］Guan Y，Breyer MD．Targeting Peroxisome Proliferators－activated recePtors(PPARs)in kidney and urologic disease［J］．Minerva Urol Nefrol，2002，54:65 －79．

［4］盧書偉，蔡皓東，崔振宇．脂肪肝的藥物治療［J］．中國新藥雜志，2001，10(12):76．