安培坤，王引權(quán)，竇莉莉，張金林，康生福

（1．甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅 蘭州730000；2．甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，甘肅 蘭州730000；

3．蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020；4．甘肅岷歸中藥材科技有限公司，甘肅 定西748400）

紅三葉（Trifolium pratense），又叫紅荷蘭翹搖、紅車軸草，為車軸草屬叢生型短期多年生豆科牧草，原產(chǎn)于小亞細(xì)亞及南歐，是全世界栽培最早和最多的重要牧草之一，我國新疆、湖北和西南地區(qū)有野生種分布［1－2］。早在1944年，甘肅岷縣從美國引進(jìn)栽培紅三葉，經(jīng)過多年栽培馴化，經(jīng)全國飼料牧草品種審定委員會審定登記，定名為岷山紅三葉（T．pratense cv．Minshan）［3］。岷山紅三葉是集草、藥為一體的優(yōu)良豆科牧草和藥用植物［4］，不僅抗寒耐濕、病蟲害少，而且優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，其鮮草產(chǎn)量3萬～9萬kg·hm－2，開花期干物質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量19%～75%，同時岷山紅三葉莖葉中含有0．7%～1．0%異黃酮類化合物［4］。許多研究證明，異黃酮類物質(zhì)在土壤中被微生物分解形成的衍生物，對其他植物有明顯的化感抑制作用［5－6］。異黃酮等酚類物質(zhì)可通過抑制受體植物細(xì)胞內(nèi)酶活性，促使細(xì)胞內(nèi)自由基失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞原生質(zhì)膜遭到破壞［7］。同時異黃酮類化感物質(zhì)能影響線粒體中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的形成，從而抑制幼苗根的呼吸作用［8］，進(jìn)一步抑制根的伸長。岷山紅三葉以種子播種繁殖生產(chǎn)，在種植當(dāng)年種植戶通常套種一年生牧草或當(dāng)季蔬菜以增加收入。然而，有關(guān)紅三葉對這些作物的化感抑制作用尚不明確。本研究選用岷山紅三葉莖葉水浸液為供體，以燕麥（Avena sativa）、披堿草（Elymus dahuricus）和小白菜（Brassica chinensis）為受體，對3種受體種子萌發(fā)及幼苗生長進(jìn)行生物測定，以明確其化感效應(yīng)，為減輕和防治作物連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試材料 供體岷山紅三葉植株采自岷縣紅三葉種植基地，受體植物燕麥和披堿草種子由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院江小雷副教授提供，小白菜種子由甘肅省武威市隴盛種業(yè)有限公司提供。燕麥、披堿草和小白菜的種子千粒重分別為28．4、4．1和3．7g。

1．2 試驗(yàn)方法 供體水浸液制備：于2011年5月下旬采集初花期岷山紅三葉健康植株，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，摘除枯黃葉片，洗凈，瀝干后，剪成2cm長的小段備用。稱取80g剪碎樣，材料與水按1∶5比例，加入蒸餾水400mL，置于室溫下浸泡48h，300 W超聲儀，25℃超聲35min，用定性濾紙和0．45 μm的濾膜進(jìn)行二重抽濾，即得質(zhì)量濃度為0．20 g·mL－1的水浸液，儲于4℃冰箱中備用。使用時再與蒸餾水按3∶1、1∶1、1∶3比例混合，分別稀釋成0．05、0．10和0．15g·mL－1濃度的水浸液［9－11］。

供體莖葉水浸液對受體植物的生物測定：采用改進(jìn)的平皿法［9］。將經(jīng)0．1%HgCl消毒10min的飽滿種子各20粒，均勻播種于放有兩層滅菌濾紙的種子發(fā)芽盒中，各試驗(yàn)組分別加入10mL的0．05、0．10、0．15和0．20g·mL－1的岷山紅三葉莖葉水浸液（對照組加10mL蒸餾水）后，置于（25±1）℃恒溫箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。以胚根突破種皮1～2mm時記錄發(fā)芽數(shù)，小白菜處理組2d后開始記錄發(fā)芽數(shù)，4d后測量根長和芽長；燕麥和披堿草處理組分別于3、4d后開始記錄發(fā)芽數(shù)，6d后測量根長和芽長。發(fā)芽率的計(jì)算公式如下：

酚類化感物質(zhì)的測定：取岷山紅三葉濾液20 mL，分別加入2%FeCl3和2%K3Fe（CN）6（體積比15∶1）混合液5mL，再加入4～5滴10%HCl溶液，調(diào)至酸性。根據(jù)溶液顏色變化判斷是否含有酚類化感物質(zhì)［12－13］。

數(shù)據(jù)處理：用Excel對種子的發(fā)芽率及幼苗的根長和芽長試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 16．0對同一植物不同濃度的岷山紅三葉水浸液處理的各試驗(yàn)組指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2．1 岷山紅三葉莖葉水浸液中化感物質(zhì)的測定 0．20g·mL－1的水浸液（A）呈黃褐色，反應(yīng)液（B）呈黃色，蒸餾水加反應(yīng)液（C）呈淺黃色。當(dāng)在0．20g·mL－1的水浸液中加入反應(yīng)液（D）時，顏色由最初的黃褐色迅速變?yōu)槟{(lán)色（圖1）。

圖1 岷山紅三葉莖葉水浸液中酚類物質(zhì)的顯色反應(yīng)Fig．1 Coloring reaction between reaction liquid and phenolic compounds in aqueous extract from the stems and leaves of Trifolium pratense cv．Minshan

2．2 岷山紅三葉莖葉水浸液對植物種子萌發(fā)的影響 4種濃度的岷山紅三葉莖葉水浸液對3種受體植物種子的發(fā)芽率均無顯著影響（P＞0．05）（表1）。說明濃度小于0．20g·mL－1的岷山紅三葉莖葉水浸液對燕麥、披堿草、小白菜種子的發(fā)芽影響不顯著。

2．3 岷山紅三葉莖葉水浸液對植物幼苗生長的影響 岷山紅三葉莖葉水浸液濃度在0．10～0．20g·mL－1時，對3種受體植物幼苗根生長有顯著影響（P＜0．05），且抑制作用隨水浸液濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)水浸液濃度為0．20g·mL－1時，燕麥、披堿草和小白菜根生長抑制率分別比對照降低23．76%、35．73%和62．50%（表2）。

表1 岷山紅三葉莖葉水浸液對3種植物種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of aqueous extract from the stems and leaves of Trifolium pratense cv．Minshan on seed germination rate of 3plant species %

表2 岷山紅三葉莖葉水浸液對3種植物幼苗根及胚芽長的影響Table 2 Effects of aqueous extract from the stems and leaves of Trifolium pratense cv．Minshan on the radicle and plumule length of 3plant species

不同濃度水浸液對燕麥的胚芽長無顯著影響（P＞0．05），對披堿草和小白菜芽的生長表現(xiàn)出不同的效應(yīng)。0．05g·mL－1水浸液濃度顯著促進(jìn)披堿草的胚芽生長（P＜0．05），較對照增加了11．97%，其他處理與對照相比無顯著影響。所有的處理濃度均顯著促進(jìn)小白菜的胚芽生長，尤其是0．15g·mL－1時，較對照增長63．64%。

3 討論與結(jié)論

高等植物的化感物質(zhì)主要是酚類、類萜、含氮化合物、聚乙炔和香豆素等次生代謝物質(zhì)，其中酚類物質(zhì)為重要的水溶性化感物質(zhì)［12］。根據(jù)酚類物質(zhì)的特性，向含酚類物質(zhì)溶液中加入2%FeCl3和2%K3Fe（CN）6（體積比15∶1）試劑后，鄰位羥基酚與Fe3＋生成綠色絡(luò)合物，間位羥基酚與Fe3＋生成藍(lán)色絡(luò)合物，且溶液中酚類物質(zhì)濃度越高，其與Fe3＋結(jié)合形成的絡(luò)合物量就越多，溶液顏色就越深［13］。由此可推測，岷山紅三葉化感物質(zhì)中含有較多的間位酚類物質(zhì)。本研究盡管定性測定出岷山紅三葉莖葉中含有較多的間位酚類物質(zhì)，表明其可能為主要化感抑制物質(zhì)，但岷山紅三葉中除了含有異黃酮類物質(zhì)之外，還含有槲皮素（Quercetin）、水楊酸（Salicylic Acid）等酚類物質(zhì)［14］，這些物質(zhì)是否也有化感抑制作用，還有待于進(jìn)一步明確。

本研究表明，不同植物幼苗芽的生長受岷山紅三葉莖葉水浸液的化感效應(yīng)不同。各濃度對小白菜幼苗根伸長均有顯著的抑制作用，且抑制作用隨水浸液濃度的增加而增強(qiáng)，濃度低于0．20g·mL－1的水浸液對燕麥、披堿草、小白菜種子的萌發(fā)均無顯著影響。李志華和沈益新［11］的研究表明，紅三葉水浸液明顯降低了高羊茅種子的發(fā)芽率，對多花黑麥草（Lolium multiflorum）、白三葉（T．repeus）、紫苜蓿（Medicago sativa）和蘿卜（Raphanus sativus）的根伸長生長有明顯的抑制作用。這說明岷山紅三葉的化感作用在受體植物種屬之間存在一定的差異。當(dāng)0．05g·mL－1岷山紅三葉莖葉水浸液對雙子葉植物小白菜的化感作用要比對單子葉植物燕麥、披堿草的作用更強(qiáng)，這可能與不同類型植物對化感物質(zhì)的敏感程度不同有關(guān)，也可能因?yàn)樗阂种屏诵“撞说挠赘扉L，從而導(dǎo)致了營養(yǎng)物質(zhì)較多轉(zhuǎn)向幼芽，為幼芽的生長提供了更多的物質(zhì)基礎(chǔ)，產(chǎn)生了幼芽生長受到促進(jìn)的現(xiàn)象。

岷山紅三葉可多年生長，且水溶性的酚類化感物質(zhì)易成鹽，所以這種酚類化感物質(zhì)在自然條件下易被土壤吸收［8］。這樣是否會導(dǎo)致岷山紅三葉連作障礙的發(fā)生以及影響程度也有待進(jìn)一步探索，此外岷山紅三葉植物中化感物質(zhì)的產(chǎn)生、釋放及作用機(jī)制也需要進(jìn)一步明確。

［1］ 杜占池，樊江文，鐘華平．營養(yǎng)元素在紅三葉葉片分解過程中的釋放動態(tài)［J］．草業(yè)科學(xué)，2003，20（7）：12－15．

［2］ 顏亮東，張國勝，李風(fēng)霞．我國北方牧區(qū)天然牧草產(chǎn)量形成的氣候模式［J］．草業(yè)科學(xué)，2003，20（7）：8－11．

［3］ 王志明，岳民勤，杜文華，等．集飼用和藥用價值于一體的牧草新秀——岷山紅三葉［J］．草業(yè)科學(xué)，2005，22（4）：33－35．

［4］ 俞聯(lián)平，李發(fā)弟，程文定，等．鉬、播種量和行距對岷山紅三葉產(chǎn)量及異黃酮含量的影響［J］．中國草地學(xué)報(bào)，2009，31（1）：52－57．

［5］ Tsanuo M K，Hassanali A，Hooper A M，et al．Isoflavanones from the allelopathic aqueous root exudate of Desmodium uncinatum ［J］．Phytochemistry，2003，64（1）：265－273．

［6］ 李壽田，周健民，王火焰，等．化感作用在雜草控制中的應(yīng)用［J］．中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，11（1）：104－106．

［7］ Romagni J G，Allen S N，Dayan F E．Allelopathic effects of volatile cineoles on two weedy plant species［J］．Journal of Chemical Ecology，2000，26（1）：303－313．

［8］ 趙福庚，何龍飛，羅慶云．植物逆境生理生態(tài)學(xué)［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：9－39．

［9］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所．NY／T1155．1－2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則除草劑第1部分：活性試驗(yàn)平皿法［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006．

［10］ 李志華，沈益新．紫花苜?；凶饔玫难芯浚跩］．草業(yè)科學(xué)，2005，22（12）：33－36．

［11］ 李志華，沈益新．紅三葉莖葉對幾種牧草種子及幼苗的化感作用［J］．中國草地，2005，27（3）：41－43．

［12］ 朱旺生，沈益新．白三葉和高羊茅對青菜幼苗生長的化感抑制效應(yīng)［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（5）：106－111．

［13］ 石碧，狄瑩．植物多酚［M］．北京：科學(xué)出版社，2000：50－51．

［14］ 彭靜波，楊文菊，李占林，等．紅車軸草的化學(xué)成分［J］．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（11）：875－879．