張彥妮，陳素波

（東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

長葉點(diǎn)地梅（Androsace longifolia）又稱矮葶點(diǎn)地梅，為報(bào)春花科點(diǎn)地梅屬多年生草本，葉叢生，線性，灰綠色，花冠白色，喉部紫紅色，5月開花［1］。點(diǎn)地梅屬約有100種，分布于北半球溫帶，其中青藏高原地區(qū)和歐洲的阿爾卑斯山脈是該屬的兩個(gè)分布中心。中國有73種，7變種，主要分布在青藏高原，有部分種類分布在西北至內(nèi)蒙古、東北以及秦嶺以南各省區(qū)。長葉點(diǎn)地梅的植株較矮小，單朵花雖小，但花色清新，開花較早，具有很高的觀賞價(jià)值。長葉點(diǎn)地梅的葉呈叢生狀，鋪地，適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠在中國東北、內(nèi)蒙古、蒙古高原［2］，草原、半干旱石質(zhì)山地的油松－沙棘混交林林下［3］，多石質(zhì)山坡生長，可用于巖石園、園林地被及盆栽觀賞及灌木叢旁作地被材料。長葉點(diǎn)地梅還具有一定的生態(tài)效益，可以降低地表濕度、減少塵土飛揚(yáng)和防止水土流失，因而它又是一種不可多得的草坪植物和優(yōu)良的地被植物，對(duì)豐富東北地區(qū)景觀植物多樣性、推動(dòng)園林事業(yè)以及綠地建設(shè)具有一定的實(shí)用價(jià)值。同時(shí)，野生花卉是構(gòu)成多樣化的生態(tài)環(huán)境和自然植被的重要組成部分，也是研究和培育花卉新品種的重要種源和進(jìn)行園林綠化的優(yōu)秀材料［4］。

長葉點(diǎn)地梅雖有諸多優(yōu)勢(shì)，但目前園林應(yīng)用極少，同時(shí)隨著生存環(huán)境的惡化，其生存狀況不斷受到威脅，資源受到破壞?？旆奔夹g(shù)是保護(hù)野生花卉種質(zhì)資源的有效途徑之一，但點(diǎn)地梅屬植物組織培養(yǎng)方面的研究迄今還是很少。聶勇［5］對(duì)點(diǎn)地梅葉片進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)，李承花等［6］采用層析法對(duì)點(diǎn)地梅的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，秦向菁［7］對(duì)點(diǎn)地梅進(jìn)行了藥理分析試驗(yàn)認(rèn)為點(diǎn)地梅在抗腫瘤方面具有一定作用。而對(duì)于野生花卉長葉點(diǎn)地梅的相關(guān)研究卻鮮見報(bào)道，因此本試驗(yàn)對(duì)長葉點(diǎn)地梅進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系的建立，以期為長葉點(diǎn)地梅種質(zhì)資源的保護(hù)、園林應(yīng)用和培育新品種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 本試驗(yàn)的研究材料為長葉點(diǎn)地梅無菌實(shí)生苗。

1．2 方法

1．2．1 不同培養(yǎng)基對(duì)長葉點(diǎn)地梅下胚軸愈傷誘導(dǎo)的影響 將培養(yǎng)皿中萌發(fā)的長葉點(diǎn)地梅轉(zhuǎn)接于添加不同激素6－BA（0、0．1、0．3mg·L－1）、NAA（0、0．1 mg·L－1）的MS培養(yǎng)基中，每組20株，觀察生長狀況，30d后統(tǒng)計(jì)生長狀況及誘導(dǎo)率。

1．2．2 愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖 試驗(yàn)中長葉點(diǎn)地梅的愈傷組織有兩種來源：一種是由葉片誘導(dǎo)而來；另一種是由萌發(fā)苗下胚軸基部產(chǎn)生。將葉片切為0．5 cm左右的小塊，接到添加不同種類、不同濃度的TDZ（0．1、0．2、0．3mg·L－1）、NAA（0．01、0．02、0．03mg·L－1）的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，之后選擇最佳培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷繼代增殖。將兩種不同的愈傷組織繼代兩次（每次周期為30d），下胚軸產(chǎn)生愈傷后，將愈傷組織與苗分離后再進(jìn)行繼代增殖，之后進(jìn)行愈傷組織的分化。30d后統(tǒng)計(jì)分化外植體數(shù)、誘導(dǎo)率和形態(tài)指標(biāo)。

1．2．3 愈傷組織的分化與植株再生 將繼代后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加不同激素的6－BA（0．5、1．0、2．0 mg·L－1）、NAA（0．1、0．2、0．4mg·L－1）分化培養(yǎng)基中，待分化出芽后，將芽接入芽伸長培養(yǎng)基中，芽伸長培養(yǎng)基為 MS＋0．1mg·L－16－BA＋0．2 mg·L－1KT。30d后統(tǒng)計(jì)愈傷分化數(shù)、分化率和平均分化芽數(shù)。

1．2．4 組培苗的生根及移栽 參照葛蓓孛［8］的移栽法，將幼苗在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基為添加不同濃度IBA（0．5、1．0、2．0mg·L－1）的MS和1／2MS培養(yǎng)基中，兩種培養(yǎng)基均加入1 g·L－1的活性炭，每組20株苗，待根長為3～4cm時(shí)，將小苗移出組培室，在溫室中不打開封口膜放置4～5d，讓組培苗適應(yīng)溫度的變化，然后半開封口膜緩苗3d，再將小苗取出，用自來水沖洗掉附著在根上的培養(yǎng)基，將苗移栽于基質(zhì)中（基質(zhì)為已滅菌的蛭石），30d后統(tǒng)計(jì)平均苗根數(shù)、平均根長、生根率、成活率及生長狀況。本試驗(yàn)無特殊說明外，均為MS培養(yǎng)基，pH 值為5．8，高壓滅菌（1．1MPa，121 ℃）15min。

1．2．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2．1 不同培養(yǎng)基對(duì)長葉點(diǎn)地梅下胚軸愈傷誘導(dǎo)的影響 植株在不同培養(yǎng)基上的生長狀況不同。在不加激素的培養(yǎng)基中植株葉片發(fā)黃，長勢(shì)一般，植株下胚軸基部無愈傷組織產(chǎn)生，但有極少量根發(fā)生，而在添加不同濃度6－BA的培養(yǎng)基中，植株葉片呈綠色或黃綠色，植株下胚軸基部有愈傷產(chǎn)生；只添加NAA的植株也有少量根產(chǎn)生，無愈傷產(chǎn)生，說明NAA有利于無菌苗根的發(fā)生。其中產(chǎn)生大量愈傷、長勢(shì)好的培養(yǎng)基為 MS＋0．3mg·L－16－BA＋0．1mg·L－1NAA，誘導(dǎo)率達(dá)85%（表1）。本試驗(yàn)獲得的植株下胚軸基部的愈傷組織可作為愈傷誘導(dǎo)芽的材料。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)長葉點(diǎn)地梅下胚軸愈傷誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of various mediums on hypocotyl callus induction

2．2 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代 不同濃度TDZ和NAA組合對(duì)長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響顯著（表2）。無激素的MS培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)葉片愈傷組織，在添加不同濃度NAA和TDZ組合的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)葉片愈傷組織大部分呈綠色，結(jié)構(gòu)緊實(shí)的愈傷長勢(shì)一般，結(jié)構(gòu)疏松的愈傷長勢(shì)相對(duì)較好。當(dāng)NAA濃度為0．02mg·L－1、TDZ濃度為0．3mg·L－1時(shí)，愈傷啟動(dòng)期為12d，愈傷顏色為淡綠色，結(jié)構(gòu)疏松，長勢(shì)好，誘導(dǎo)率達(dá)80%；所以誘導(dǎo)葉片愈傷的最佳NAA和TDZ組合為0．02 mg·L－1NAA ＋0．3mg·L－1TDZ。

2．3 愈傷組織誘導(dǎo)再生芽 以兩種來源不同的愈傷組織誘導(dǎo)芽分化，結(jié)果表明（表3），苗基部愈傷組織的分化率明顯大于由葉片誘導(dǎo)的愈傷。當(dāng)6－BA濃 度 為 1．0mg·L－1、NAA 濃 度 為 0．2 mg·L－1時(shí)，葉片愈傷的分化效果最好，分化率為82．5%，平均分化芽數(shù)為4．3。當(dāng)6－BA濃度為0．5 mg·L－1、NAA濃度為0．2mg·L－1時(shí)，苗基部愈傷的分化效果最好，分化率為92．5%，平均分化芽數(shù)為6．1。來自下胚軸的愈傷組織的平均分化芽數(shù)高于葉片愈傷平均分化芽數(shù)，主要是由于下胚軸的胚性愈傷形成率高于葉片的胚性愈傷形成率。因此，苗下胚軸基部愈傷為誘導(dǎo)芽的最佳愈傷，最佳激素比為0．5mg·L－16－BA＋0．2mg·L－1NAA。

2．4 組培苗的生根及移栽 將在芽伸長培養(yǎng)基上生長為3～4cm的無菌苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)。在生根試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)（表4），添加不同濃度IBA的MS和1／2MS兩種培養(yǎng)基，前者的生根率均達(dá)到100%，移栽后的成活率及狀況相對(duì)最好；前者的平均苗根數(shù)最多為7．3，平均根長最長為2．7，成活率達(dá)95%，移栽后植株長生新葉較多，后者的平均苗根數(shù)最多為4．9，平均根長最長為1．8，成活率達(dá)89．5%，移栽后產(chǎn)生的新葉相對(duì)較少。因此，組培苗的最佳生根培養(yǎng)基為 MS＋1．0mg·L－1IBA。

表2 不同濃度TDZ和NAA組合對(duì)長葉點(diǎn)地梅葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different combinations of TDZ and NAA on callus induction from leaf

表3 不同濃度6－BA和NAA組合對(duì)愈傷誘導(dǎo)芽的影響Table 3 Effects of different combinations of 6－BA and NAA on bud induction

表4 組培苗的生根及成活狀況Table 4 Status of plant rooting and survival

圖1 葉片愈傷的誘導(dǎo)（A）、增殖（B）、分化（C），下胚軸愈傷的誘導(dǎo)（D）、分化（E）、增殖（F）和組培苗的生根（G）及移栽（H）Fig．1 Callus induced from leaves（A），multiplication of callus（B）and differentiation（C），callus induced from hypocotyl（D），multiplication of hypocotyl callus（E）and differentiation（F），rooting（G）and transplanting（H）

3 討論與結(jié)論

本研究以長葉點(diǎn)地梅的實(shí)生苗及其葉片來誘導(dǎo)愈傷組織，初步建立植株再生體系，實(shí)現(xiàn)長葉點(diǎn)地梅的快繁（圖1）。不同植物激素對(duì)幼苗的生長影響不同，只添加NAA的植株19d后下胚軸周圍少膨大，變褐色，25d后有少量根產(chǎn)生，說明NAA有利于無菌苗根的發(fā)生，但不能誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織。當(dāng)6－BA與NAA共同作用時(shí)，無根發(fā)生，植株下胚軸基部均出現(xiàn)愈傷組織，說明6－BA能夠促進(jìn)愈傷的形成，其中發(fā)生愈傷效果最佳的培養(yǎng)基為 MS＋0．3 mg·L－16－BA＋0．1mg·L－1NAA。

目前，TDZ在愈傷組織誘導(dǎo)［9－12］、體胚細(xì)胞發(fā)生［13］、叢生芽誘導(dǎo)［14－15］、內(nèi)源激素水平［16］等方面都有所應(yīng)用。本研究在葉片誘導(dǎo)愈傷的過程中，高濃度的TDZ和NAA都會(huì)在一定程度上抑制愈傷組織的發(fā)生，在培養(yǎng)基 MS＋0．02mg·L－1NAA和0．3mg·L－1TDZ上誘導(dǎo)出的愈傷淡綠疏松、長勢(shì)好，因此，為葉片誘導(dǎo)愈傷的最佳培養(yǎng)基。在愈傷組織分化試驗(yàn)中，植株下胚軸基部產(chǎn)生的愈傷其分化能力優(yōu)于葉片愈傷，在最佳培養(yǎng)基 MS＋0．5 mg·L－16－BA＋0．2mg·L－1NAA 上，愈傷分化率最高，達(dá)92．5%，平均分化芽個(gè)數(shù)最高達(dá)6．1。有的植物的不同部位產(chǎn)生的愈傷，其分化能力也會(huì)有一定的差別，如萵苣（Lactuca sativa）子葉和真葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織和再生苗頻率與下胚軸相比會(huì)相對(duì)較低［17］。通過下胚軸基部的愈傷建立植株再生體系已經(jīng)在豆科牧草沙打旺（Astragalus adsurgens）等植物中研究應(yīng)用［18－19］，是建立再生體系的有效途徑。在誘導(dǎo)生根的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基更有利于植株的生根成活，IBA濃度過高或過低都會(huì)影響植株的根數(shù)、根長及移栽苗的成活率，當(dāng)IBA濃度為1．0mg·L－1IBA時(shí)，植株的根較長，量多，有較多新葉產(chǎn)生，為最佳生根培養(yǎng)基。

本試驗(yàn)以長葉點(diǎn)地梅種子為外植體，通過葉片愈傷及下胚軸愈傷誘導(dǎo)芽，并進(jìn)行生根培養(yǎng)，從而建立起完整的再生體系，為以后的組培快繁等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ 柳參奎．中國東北鹽堿地植物原色圖鑒［M］．哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，2006：123．

［2］ 岳秀賢．蒙古高原種子植物區(qū)系研究［D］．呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：153－154．

［3］ 李杰．半干旱石質(zhì)山地不同造林模式適應(yīng)性研究［D］．呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：24－25．

［4］ 周濤，樸永吉，林元雪．中國野生花卉資源的研究現(xiàn)狀及展望［J］．世界林業(yè)研究，2004，17（4）：45－48．

［5］ 聶勇．2，4－D和6－BA 對(duì)點(diǎn)地梅愈傷組織誘導(dǎo)的影響［J］．阿壩師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2006，23（4）：126－128．

［6］ 李承花，殷志琦，黃曉君，等．點(diǎn)地梅的化學(xué)成分［J］．中國天然藥物，2008，6（2）：123－125．

［7］ 秦向菁．抗乙型肝炎病毒藏藥及活性部位的研究［D］．北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，2004：16－28．

［8］ 葛蓓孛．細(xì)葉百合組織培養(yǎng)及多倍體誘導(dǎo)研究［D］．哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010：9－17．

［9］ Van Le B，Nhut D T，Van K T T．Plant production via shoot regeneration from thin cell layer pseudo－bulblet explants of Lilium longiflorum in vitro［J］．Plant biology and Pathology，1999，322：303－310．

［10］ Loretta B，Patrizio C R，Claudia B，et al．Adventitious shoot regeneration from leaf explants and stem nodes of Lilium［J］．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，74：37－44．

［11］ 姜新超．百合懸浮細(xì)胞體系的建立及植株再生［D］．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010：3－31．

［12］ 蔣晶，竇美安，孫偉生．菠蘿花藥愈傷組織誘導(dǎo)及褐變影響因素［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（11）：366－369．

［13］ Sheibani M，Nemati S H，Davarinejad G H，et al．Induction of somatic embryogenesis in saffron using thidiazuron（TDZ）［J］．Pakistan Journal of Biological Sciences，2007，739：259－267．

［14］ 高翔，羅鴻源．蕓苔叢生芽誘導(dǎo)和快速繁殖［J］．植物生理學(xué)通訊，1995，31（6）：429－435．

［15］ 顧地周，高捍東，馮穎，等．不同激素對(duì)黃檗腋芽叢生芽苗誘導(dǎo)及種質(zhì)試管保存的影響［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（9）：255－258．

［16］ 馬光，郭繼平．TDZ和6－BA對(duì)蕪菁離體再生過程中內(nèi)源激素水平的不同影響［J］．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2010，36（3）：237－245．

［17］ 高輝，茍曉松，鄧運(yùn)濤，等．萵苣‘紅帆’品種下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生［J］．園藝學(xué)報(bào)，2002，29（5）：486－488．

［18］ Luo J P，Jia J F．Callus induction and plant regeneration from hypocotyl explants of the forage legume Astragalus adsurgens［J］．Plant Cell Reports，1998，17：567－570 ．

［19］ Shang A Q，Cai H，Yan X J，et al．Plant regeneration fromin vitro cultured of hypocotyl explants of Euonymus japonicus Cu zhi［J］．Agricultural Sciences in China，2006，5（3）：196－201．