柴海毅

（上海諾狄生物科技有限公司，上海 201612）

目前國內(nèi)各制藥企業(yè)環(huán)境監(jiān)測中微生物的監(jiān)測方法大多依據(jù)GB/T 16293-2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法和GB/T 16294-2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法進行。以這兩個國標來實施監(jiān)測制藥企業(yè)潔凈室的微生物，對大多數(shù)生產(chǎn)普通制劑或API的廠家來說是沒有問題的。

但是對于抗生素企業(yè)和部分制劑廠家來說，僅僅按照這兩個國標推薦的兩種培養(yǎng)基大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）來監(jiān)測潔凈室的微生物則是不全面的。在抗生素生產(chǎn)企業(yè)，其潔凈室內(nèi)不可避免地混雜著一定量的抗生素粉塵，如果沒有采取能夠消除抗生素粉塵對微生物生存和生長的影響的措施，就采用國標的方法測試該環(huán)境中的微生物，得到的監(jiān)測結果，不可避免的將是一個“假陰性”的結果；同樣，部分藥物的API對個別微生物也有不同程度的抑制或殺滅作用，要是不消除這類影響微生物生存和生長的環(huán)境因素，同樣會得到“假陰性”的結果。

現(xiàn)在國內(nèi)絕大多數(shù)制藥企業(yè)環(huán)境監(jiān)測中微生物取樣的培養(yǎng)基是檢驗員人工制作，培養(yǎng)基滅菌，澆制平板，預培養(yǎng)后剔除污染的平板后置冷藏箱內(nèi)待用，保存期限一般不超過3周。采用這樣的方法進行環(huán)境監(jiān)測微生物的取樣，因為無法從根本上保證取樣平板的無菌性，得到的監(jiān)測結果不可避免的是一個“假陽性”的結果。

“假陰性”和“假陽性”兩個結果都沒有真實的還原潔凈室內(nèi)微生物的實際狀況。取樣測試的結果與潔凈室內(nèi)微生物實際狀況出現(xiàn)了偏差。這樣的結果如果發(fā)生在A級或B級區(qū)，由此產(chǎn)生的眾多調(diào)查、重復測試等工作量，將會導致大量的經(jīng)濟損失。

“假陰性”和“假陽性”兩個結果的產(chǎn)生，就是因為在環(huán)境監(jiān)測微生物取樣測試時忽視了這樣兩個問題，忽視了潔凈環(huán)境中存在的抑菌成分；忽視了取樣平板的無菌性。

1 潔凈環(huán)境中的抑菌成分的消除

制藥企業(yè)潔凈環(huán)境中的抑菌成分主要有這樣兩大類：①API；②消毒劑殘留。

1.1 API主要分為這樣兩部分：抗生素和部分API

消除抗生素粉塵的殘留，采用的方法就是降解取樣時落在培養(yǎng)基平板上的抗生素，在取樣平板的培養(yǎng)基內(nèi)添加一定量的酶，對于β-內(nèi)酰胺類抗生素，添加β-內(nèi)酰胺酶 （即青霉素酶）；對于頭孢類抗生素，則添加頭孢菌素酶。

而API的消除，則主要依據(jù)：“中國藥典”2010年版 附錄109頁 附錄XI J 表1：“常見干擾物中和劑或滅活方法” 中所對應的中和或滅活方法，還有一個方法就是借鑒相關產(chǎn)品微生物檢驗方法驗證中所采取的中和或滅活方法來消除API的影響。

1.2 消毒劑殘留

制藥企業(yè)潔凈環(huán)境每天都在使用消毒劑，怎樣確定殘留的消毒劑沒有影響微生物的生長？選擇什么樣的培養(yǎng)基可以最大限度的衡量潔凈室表面的微生物水平？理論知識告訴我們，卵磷脂、吐溫-80組合后能夠消除季胺類化合物（苯扎溴銨、苯扎氯銨等）消毒劑的影響；卵磷脂、吐溫-80和L-組氨酸組合后能夠消除醛類（甲醛、戊二銓等）和酚類（苯酚、間苯二酚等）消毒劑的影響；硫代硫酸鈉能夠消除鹵素類消毒劑（碘伏、碘酒等）的影響等。

現(xiàn)在，國外制藥企業(yè)環(huán)境微生物監(jiān)測時，用于潔凈室表面取樣的培養(yǎng)基大多為大豆酪蛋白+卵磷脂+吐溫-80瓊脂培養(yǎng)基（即TSAWLP）。選擇這樣的培養(yǎng)基就可以有效的降解可能殘留在潔凈室表面的消毒劑（主要是季胺類化合物消毒劑）的殘留。

2 取樣平板的無菌性

《中國藥典》2010年版中對用于環(huán)境監(jiān)測的培養(yǎng)基平板有明確的要求。用于環(huán)境監(jiān)測的培養(yǎng)基須特別防護，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么，在使用前應進行100%的預培養(yǎng)以防止外來的污染物帶到環(huán)境中以避免出現(xiàn)假陽性的結果[1]。由此可見，在法規(guī)層面，對于制藥企業(yè)潔凈室環(huán)境中微生物測試的培養(yǎng)基提出了嚴格要求。要求在潔凈室取樣時采用無菌的預制培養(yǎng)基平板（即Ready to- use Culture Media Plate）取樣。

事實上，國外眾多的制藥企業(yè)用于潔凈環(huán)境測試的培養(yǎng)基平板，包括：浮游菌、沉降菌取樣的90mm普通平板和表面取樣的55mm接觸平板都是無菌的預制平板培養(yǎng)基?！吨袊幍洹?010年版中對用于環(huán)境監(jiān)測的培養(yǎng)基的要求就是出自USP〈1117〉MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 章節(jié)[2]。

對比中國藥典和USP兩部藥典在環(huán)境監(jiān)測培養(yǎng)基的具體要求，USP還特別強調(diào)了預培養(yǎng)之后必須要進行的促生長試驗（即Growth Promotion Testing），這里也凸顯了USP在強調(diào)避免微生物測試結果“假陽性”的同時，更加關注的是微生物測試結果的“假陰性”?，F(xiàn)代微生物檢測領域，“假陰性”遠比“假陽性”要可怕，制藥企業(yè)潔凈環(huán)境中微生物的檢測，使用無菌預制平板培養(yǎng)基，不僅完全杜絕了測試結果的“假陽性”，同時也消除了“假陰性”的可能。也符合了中國GMP規(guī)范2010年版中大力提倡的風險管理的理念。

3 制藥企業(yè)潔凈環(huán)境微生物監(jiān)測的解決方案

針對制藥企業(yè)潔凈環(huán)境微生物監(jiān)測中忽視的問題，在設計一個潔凈室的微生物監(jiān)測方案時，應該著力避免這兩個問題。在培養(yǎng)基中添加β-內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶是一定要做驗證的，就是要驗證所添加酶或中和劑的種類和劑量能夠完全降解掉環(huán)境中的抑菌因素，從而真實還原本企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中可能存在的微生物的真實水平。避免環(huán)境監(jiān)測微生物“假陽性”或“假陰性”結果，另一行之有效方法就是采用無菌預制培養(yǎng)基平板（Ready to- use Culture Media Plate）取樣。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國中國藥典：2010年版二部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄XIX Q.

[2] 美國藥典委員USP 33版〈1117〉MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES.