曹志剛 綜述 邵志敏 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

2008年全球乳腺癌新發(fā)病例138萬(wàn)，占女性癌癥發(fā)病總數(shù)的23%；46萬(wàn)人死于該病，占女性癌癥死亡人數(shù)的14%［1］。在中國(guó)的上海等大中城市，乳腺癌患病率已連續(xù)20年位居女性惡性腫瘤第一位［2］，嚴(yán)重危害廣大女性的健康。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)分子調(diào)控人體基因組內(nèi)約1/3的基因表達(dá)［3］，其與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4-6］，這對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療和預(yù)后判斷都有重要意義。目前已知影響乳腺癌預(yù)后的因子有多種，主要分為臨床病理學(xué)和生物學(xué)兩類。生物學(xué)因子主要表現(xiàn)在DNA和RNA水平，而miRNA作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物因其特殊的穩(wěn)定性及特異性已顯示了特有的優(yōu)越性。本文就miRNA在乳腺癌診斷及預(yù)后判斷中的作用作一綜述。

1 miRNA分子概述

miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)轉(zhuǎn)錄的，一般最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾的pri-miRNA。這些pri-miRNA在RNase Ⅲ Drosha和其輔助因子Pasha的作用下，被處理成70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNA前體產(chǎn)物。在核膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助下前體分子被輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后另一個(gè)RNaseⅢ Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRISC)中，成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合物中［7-9］。

目前的研究認(rèn)為miRNA主要通過(guò)兩種機(jī)制進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控［10］，①miRNA序列與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslated region，3'-UTR) 結(jié)合，如果兩者堿基序列完全互補(bǔ)，miRNA則促使靶基因的mRNA發(fā)生降解；②miRNA與靶基因mRNA的3'-UTR的結(jié)合，堿基序列不完全互補(bǔ)，則阻止靶基因mRNA的翻譯，但不影響其穩(wěn)定性。miRNA的表達(dá)失調(diào)，可引起大量相關(guān)基因的表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，甚至出現(xiàn)癌變。

應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)乳腺癌及癌旁組織miRNA的差異性表達(dá)，可發(fā)現(xiàn)一些與乳腺癌相關(guān)的miRNA。Calin等［11］通過(guò)分析miRNA在染色體上的定位與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)186個(gè)miRNA基因中15個(gè)miRNA定位于10個(gè)與人類乳腺癌相關(guān)的缺失區(qū)。Iorio等［12］運(yùn)用miRNA基因芯片及Northern blot等方法對(duì)76例乳腺癌樣本和10例乳腺正常標(biāo)本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)29種miRNA的表達(dá)有顯著變化，且有15種miRNA可以明確區(qū)分腫瘤或正常乳腺樣本，其中miR-10b、miR-125b和miR-145在大多數(shù)乳腺癌組織和細(xì)胞中顯著低表達(dá)，而miR-21和miR-155表達(dá)量則明顯下降。這表明在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，起癌基因與抑癌基因作用的miRNA都發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，此外也揭示這些miRNA與乳腺腫瘤的分級(jí)、分期、血管侵襲性及腫瘤細(xì)胞增殖和雌、孕激素的表達(dá)等臨床病理指數(shù)均相關(guān)。越來(lái)越多的研究證實(shí)，miRNA與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)，miR-21、miR-10b、miR-373、miR-520c等在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)乳腺癌的侵襲、遷移［13-15］；而miR-31、miR-126、miR-335在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)明顯下調(diào)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移［16-19］。有趣的是，miR-200家族在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演了一個(gè)“兩面派”的角色［20］，一方面miR-200s能減緩原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞向血液循環(huán)系統(tǒng)的初始逃逸，抑制這個(gè)過(guò)程中癌癥的擴(kuò)散速度；另一方面當(dāng)癌細(xì)胞已經(jīng)逃逸時(shí)，尋找新的“殖民地”(如肺部)的時(shí)候，這個(gè)相同的小分子竟又能夠幫助促進(jìn)這個(gè)過(guò)程。

2 miRNA與乳腺癌的診斷

現(xiàn)有研究已經(jīng)顯示miRNA可作為“癌癥指紋”，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測(cè)成本較低的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的腫瘤生物標(biāo)志物，在腫瘤的診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.1 組織miRNA表達(dá)與乳腺癌的診斷

Rosenfeld等［21］報(bào)道了基于253例不同腫瘤樣本的48種miRNA 表達(dá)譜結(jié)果，根據(jù)上述結(jié)果對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行的雙盲驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，基于miRNA的未知來(lái)源轉(zhuǎn)移灶分類的準(zhǔn)確性超過(guò)了90%，顯示miRNA在腫瘤診斷中的巨大應(yīng)用前景。Yan等［22］分析了113例乳腺癌標(biāo)本的miRNA表達(dá)譜，在這些異常表達(dá)的miRNA中，miR-21的上調(diào)最明顯，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，miR-21的高表達(dá)與乳腺癌的臨床病理特征，如惡性臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Imam等［23］研究分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中miR-185表達(dá)明顯下降，其靶基因表達(dá)水平則明顯上升。有學(xué)者鑒定了13 種miRNA在炎性乳腺癌和非炎性乳腺癌組織中的表達(dá)情況，一共檢測(cè)了17 295對(duì)miRNA-mRNA，發(fā)現(xiàn)有10 283對(duì)呈正相關(guān)，7 012對(duì)呈負(fù)相關(guān)；其中miR-29a、miR-30b、miR-342-3p和miR-520-5p的靶基因與預(yù)測(cè)的相同；miR-335、miR-548d-5p和miR-451在炎性乳腺癌中過(guò)表達(dá)，miR-15a、miR-24、miR-29a、miR-30b、miR-320、miR-342-5p、miR-342-3p、miR-337-5p 和miR-520a-5p在炎性乳腺癌中低表達(dá)，為乳腺癌的診斷提供了重要的依據(jù)［24］。Sempere等［25］對(duì)100多例乳腺癌患者的標(biāo)本利用原位雜交法測(cè)定miRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-21在乳腺癌組織中表達(dá)增加，而let-7表達(dá)減少，miR-145和miR-205在正常乳房導(dǎo)管及小葉肌上皮和基底細(xì)胞層表達(dá)，而在對(duì)應(yīng)的乳腺癌標(biāo)本中表達(dá)下降或完全不表達(dá)，其研究還發(fā)現(xiàn)miR-145在非典型性增生和乳腺癌中表達(dá)明顯增加，這提示miR-145可能有希望作為乳腺癌新的早期診斷標(biāo)志物。Blenkiraon等［26］研究表明miRNA表達(dá)譜還可以區(qū)分乳腺癌的5個(gè)亞型，即luminalA型、luminalB型、HER-2過(guò)表達(dá)型、Basal-like型(三陰型)和Normal-like型，為乳腺癌的分子分型及個(gè)體化治療提供了理論依據(jù)。

2.2 血清miRNA表達(dá)與乳腺癌的診斷

miRNA在血清中可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長(zhǎng)期保存等各種處理方法均不會(huì)造成血清miRNA的損失［27］。由于腫瘤存在高度異質(zhì)性，組織學(xué)取材不能完全代表整體腫瘤組織，而外周血腫瘤核酸可起源于腫瘤內(nèi)部任何一個(gè)亞克隆的群體，因此能更全面反映腫瘤組織豐富的異常分子改變［28］。

至今已報(bào)道的多項(xiàng)血清microRNA 與腫瘤的研究工作，為血清miRNA作為分子標(biāo)志應(yīng)用于腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷提供了工作基礎(chǔ)。Zhou等［29］在肝癌血漿中篩選到了由7個(gè)microRNA組成的早期肝癌診斷分子標(biāo)志物，并利用這7個(gè)血漿microRNA建立了一個(gè)診斷模型，對(duì)于<2 cm的肝癌診斷準(zhǔn)確率接近90%，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的AFP。Zhu等［30］對(duì)乳腺癌患者血清miR-155的含量進(jìn)行了小樣本的研究，發(fā)現(xiàn)血清miR-155 水平在乳腺癌患者和非乳腺癌患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在癌組織孕酮受體陽(yáng)性的患者中血清含量要高于陰性患者，提示miR-155 可以作為區(qū)分激素敏感性和非敏感性的乳腺癌患者的分子標(biāo)志物，進(jìn)一步證明血清microRNA 具有成為腫瘤診斷標(biāo)志物的潛力。Heneghan等［31］挑選了與乳腺癌相關(guān)的7個(gè)miRNA在乳腺癌患者的腫瘤組織和血漿中進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)miR-195 是乳腺癌組織特異的miRNA，在血漿中的水平高于正常水平，能很好地反映患者腫瘤生長(zhǎng)的臨床病理特征。Zhao等［32］通過(guò)比較20例早期乳腺癌患者(10例美國(guó)白人和10例美國(guó)黑人)以及相應(yīng)匹配的20例健康人群(10例美國(guó)白人和10例美國(guó)黑人)的血清miRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，血清循環(huán)miRNA可以作為潛在的乳腺癌早期診斷的新的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物；研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在美國(guó)白人中有31個(gè)差異表達(dá)的miRNA(17個(gè)表達(dá)上調(diào)，14個(gè)表達(dá)下調(diào))，在美國(guó)黑人中有18個(gè)差異表達(dá)的miRNA(9個(gè)表達(dá)上調(diào)，9個(gè)表達(dá)下調(diào))，有趣的是，僅有2種miRNA在美國(guó)黑人和白人中均有差異表達(dá)，提示血清miRNA的表達(dá)具有種族差異性。Schrauder等［33］通過(guò)miRNA表達(dá)譜檢測(cè)了早期乳腺癌和健康對(duì)照外周血miRNA的表達(dá)，結(jié)果提示有59個(gè)miRNA有差異表達(dá)，其中13個(gè)顯著上調(diào)，46個(gè)顯著下調(diào)；通過(guò)RBF核函數(shù)的支持向量機(jī)技術(shù)建立模型，其特異度為78.8%，靈敏度為92.5%，準(zhǔn)確率為85.6%。Schwarzenbach等［34］發(fā)現(xiàn)血清miR-214表達(dá)水平可以區(qū)分乳腺癌、乳腺良性腫瘤及健康對(duì)照人群，ROC曲線下面積為0.878和0.883，結(jié)果提示血清游離miR-214是潛在的乳腺癌診斷標(biāo)志。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-215、miR-299-5p、miR-411和miR-452在乳腺癌組織和血清中存在差異表達(dá)，能夠幫助區(qū)分乳腺癌患者和健康對(duì)照，尤其是血清miR-452的異常表達(dá)能夠提示乳腺癌患者是否發(fā)生體內(nèi)轉(zhuǎn)移［35］。

3 miRNA與乳腺癌的預(yù)后判斷

特定的miRNAs表達(dá)模式與腫瘤的預(yù)后相關(guān)，因此miRNAs還可能有助于乳腺癌的預(yù)后判斷。Camps等［36］分析了219例乳腺癌患者預(yù)后發(fā)現(xiàn)，miR-210與HIF-1a信號(hào)通路相關(guān)，miR-210的表達(dá)水平與乳腺癌的無(wú)病生存率和總生存率呈負(fù)相關(guān)。因此，miR-210可能是乳腺癌預(yù)后差的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Toyama等［37］檢測(cè)了58例三陰性乳腺癌患者及103例ER陽(yáng)性HER2陰性患者miR-210表達(dá)情況及其與臨床病理的關(guān)系，證實(shí)miR-210在三陰性乳腺癌的表達(dá)水平顯著高于ER陽(yáng)性HER2陰性乳腺癌患者(P<0.001)，也提示了miR-210表達(dá)與無(wú)病生存期和整體生存顯著負(fù)相關(guān)，miR-210高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良。Valastyan等［19］發(fā)現(xiàn)miR-31在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，且miR-31與乳腺癌的無(wú)轉(zhuǎn)移生存率呈負(fù)相關(guān)，miR-31可能是各種亞型乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志，用來(lái)判斷乳腺癌的預(yù)后。Yan等［22］和Lee等［38］均發(fā)現(xiàn)miR-21的高表達(dá)與乳腺癌的臨床病理特征，如惡性臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差顯著相關(guān)。有報(bào)道顯示，在246例進(jìn)展期ER陽(yáng)性、接受他莫昔芬治療的患者中，miR-30c能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)無(wú)疾病進(jìn)展存活期［39］。Svoboda等［40］利用qRT-PCR方法檢測(cè)了39例三陰性乳腺癌患者miR-34a、miR-34b、miR-34c的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-34b表達(dá)與無(wú)病生存期和整體生存顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-34b可作為預(yù)測(cè)三陰性乳腺癌患者預(yù)后新的標(biāo)志物。Buffa等［41］報(bào)道了利用乳腺癌完整的mRNA和miRNA表達(dá)譜確定了miRNA相關(guān)的進(jìn)展途徑和潛在治療靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在雌激素受體陽(yáng)性患者有4個(gè)miRNA、雌激素受體陰性患者有6個(gè)miRNA與無(wú)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)生密切相關(guān)，在三陰性乳腺癌中miR-342，miR-27b及miR-150可以作為預(yù)后標(biāo)志；其他幾個(gè)獨(dú)立研究也證實(shí)，miR-210，miR-128a和miR-27b及其靶基因都具有預(yù)后標(biāo)志的作用。Hanna等［42］利用組織芯片方法檢測(cè)了473例乳腺癌患者組織miR-21、miR-92a、miR-34a和miR-221的表達(dá)水平，結(jié)果提示，miR-221是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素。Volinia等［43］研究發(fā)現(xiàn)9個(gè)miRNA在原位癌及浸潤(rùn)癌組織中差異表達(dá)，其中l(wèi)et-7d、miR-210和miR-221在原位癌中表達(dá)下調(diào)，在浸潤(rùn)癌中表達(dá)上調(diào)；同時(shí)提示，miR-210、miR-21、miR-106b、miR-197和 let-7i可以作為預(yù)后的生物標(biāo)志；miR-210與腫瘤的侵襲有關(guān)，miR-210的靶基因BRCA1、FANCD、FANCF、PARP1、E-cadherin和Rb1在原位癌中高表達(dá)，在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)下調(diào)。

4 展望

對(duì)miRNA的深入研究無(wú)疑能增進(jìn)對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等機(jī)制的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)診斷和治療的快速發(fā)展。當(dāng)然，作為敏感性較高的分子標(biāo)志，其統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)仍需時(shí)日得以公認(rèn)。此外，miRNA與臨床相關(guān)的研究剛剛起步，尚缺乏大樣本、多中心、前瞻性的研究數(shù)據(jù)。隨著miRNAs微陣列、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、SNP分析和Northern blot 等各種技術(shù)平臺(tái)的不斷發(fā)展，miRNAs表達(dá)的檢測(cè)日益精確可靠，將為乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷開(kāi)辟了新途徑，相信不久的將來(lái)，隨著越來(lái)越多的可靠數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，miRNA作為乳腺癌診斷、治療、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷的重要分子標(biāo)志物可得到極大程度的認(rèn)可和推廣。

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