尹 恒高啟平謝 駿劉 波李云蘭

(1.通威股份有限公司，四川成都 610041；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室，江蘇無錫214081)

腸道作為魚類自身最大的免疫器官，腸道健康狀況直接影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，同時也影響魚體的免疫、抗病力，腸道健康狀況在養(yǎng)殖中越來越受到重視。保持魚類腸道健康必須要有充足的營養(yǎng)供給、保證原料的新鮮、添加藥物如抗生素等措施，但由于不規(guī)范用藥的現(xiàn)象比較突出，藥殘的問題成為大家關(guān)注的熱點。既要減少藥殘，又要促進動物腸道健康，添加微生態(tài)制劑成了目前有效的方式之一。

微生態(tài)制劑作為抗生素的替代選擇，可以降低藥物殘留、促進動物生長、提高健康水平，維護生態(tài)平衡，在養(yǎng)殖與飼料中的研究與應(yīng)用日益得到重視與加強。應(yīng)用于養(yǎng)殖的微生物菌種包括：芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、光合細菌、硝化細菌等單一菌群微生態(tài)制劑或不同菌群的復(fù)合微生態(tài)制劑，而芽孢桿菌由于有較強的產(chǎn)胞外酶的能力，能刺激并提高動物免疫能力，同時穩(wěn)定性好、抗性強、復(fù)活率高，在養(yǎng)殖及飼料中的研究應(yīng)用較多。已有研究表明，在水產(chǎn)飼料中添加芽孢桿菌，可以抑制腸道內(nèi)有害菌的繁殖，促進腸道有益菌生長，維持動物腸道的菌群平衡，同時可以提高動物的消化酶活性，增強機體免疫功能，達到促進動物生長。但目前研究菌種主要集中在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌上，蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌在水產(chǎn)動物中的研究應(yīng)用則較少。因此，本試驗以當(dāng)年建鯉作為試驗對象，比較研究在實用飼料中添加枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等3種芽孢桿菌對鯉魚的生長和腸道菌群的影響，為芽孢桿菌的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

試驗選用的當(dāng)年建鯉購自德陽養(yǎng)殖戶處，初始平均體重為（14.62±0.11）g，體質(zhì)健康。

將魚種隨機分成4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)120尾，共12個水泥池（規(guī)格為7 m×7 m×1.5 m）。

1.2 飼料與試驗設(shè)置

共設(shè)計4種試驗料，編號為1號、2號、3號、4號，其中,1號為對照料，2號、3號、4號分別在1號料的基礎(chǔ)上添加0.1%凝結(jié)芽孢桿菌(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心提供)、0.1%蠟樣芽孢桿菌 (通威股份水產(chǎn)科技公司基因研究室提供)、0.1%枯草芽孢桿菌(湖北某廠家提供),菌種采用逐級稀釋添加到預(yù)混料中,再與大原料充分混合均勻，飼料中所含的細菌個數(shù)均為1.5×1010個/kg。試驗飼料在通威股份有限公司四川分公司生產(chǎn)，先配后粉工藝，料型為沉性硬顆粒飼料，原料80%過40目篩，三級調(diào)質(zhì)器，調(diào)質(zhì)溫度90℃,粒徑為4.5 mm，日糧配方組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗料配方及營養(yǎng)水平（g/100 g）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在室外的水泥池中進行（7 m×7 m×1.5 m，每個水泥池由聚乙烯網(wǎng)片和鋼管隔成四格,每個格子為1個重復(fù),由于各試驗池的條件存在一定差異,各試驗組均設(shè)1個對照組）。各池均有獨立的進排水口,水源為東風(fēng)渠道來水 (都江堰來水)。試驗從2008年6月14日開始，至9月16日結(jié)束,養(yǎng)殖94 d，試驗期間平均水溫為27.3℃，平均溶氧大于5mg/l，pH值8.0，氨氮平均值0.2mg/l,亞硝酸鹽平均值0.001 5mg/l,COD平均值5.57mg/l。所有試驗組日投飼3次，各處理組之間保持相同投飼率，每隔一段時間根據(jù)魚的攝食情況調(diào)整投飼量。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長指標(biāo)

生長試驗結(jié)束后，測定各組的總體重，計算飼料系數(shù)（FCR）、特定生長率（SGR）。

飼料系數(shù)（FCR）＝投飼總量/增重量；

特定生長率(SGR，%/d)＝（Ln末重-Ln 初重）/養(yǎng)殖天數(shù)×100。

1.4.2 腸道菌群測定

生長試驗結(jié)束后，每個處理組隨機取3尾魚（飽食投喂2 h后），用75%酒精消毒魚體表，打開腹腔消毒腸管外壁，無菌棉線結(jié)扎，用無菌水沖洗，無菌條件下取出中腸食糜。用無菌生理鹽水配成10-1～10-5倍菌懸液，選 10-3、10-4、10-5三個稀釋度，每個稀釋度各取100 μl以平板涂布法均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上，放于培養(yǎng)箱中，在30℃下需氧培養(yǎng)24 h后，取菌落數(shù)在30～300個之間的稀釋度進行計數(shù)報告，所測菌群數(shù)量用lgcfu/g表示。

異養(yǎng)細菌總數(shù)測定采用LB培養(yǎng)基（自配）：胰蛋白胨 10 g/l、酵母提取物 5 g/l、NaCl 5 g/l，加水定容至1 000 ml，用1 mol/l的NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.4。

大腸桿菌（腸道致病菌及腸球菌）分離培養(yǎng)基：采用麥康凱選擇培養(yǎng)基（MAC），市售，杭州天和試劑廠。

致病性弧菌的選擇性培養(yǎng)：采用TCBS選擇培養(yǎng)基（硫代硫酸鈉-枸椽酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板），市售，杭州天和試劑廠。

乳酸菌選擇培養(yǎng)基：采用改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基(TJA)(自配)：番茄汁 50 ml、酵母浸粉 5 g、牛肉浸膏 10 g、乳糖 20 g、葡萄糖 2 g、吐溫-80 1 ml、醋酸鈉 5 g、瓊脂15 g、蒸餾水 1 000 ml，調(diào) pH 值到 6.8±0.2。

以上所有培養(yǎng)基配好后，121℃高壓蒸汽滅菌15～20 min。

每克腸道食糜菌落數(shù)(cfu/g)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10（如果涂布量為 50 μl，則×20）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)作單因素方差分析(one way ANOVA)，若組間差異顯著，則做Duncan′s法多重比較，顯著水平P采用0.05。所有的結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 添加3種芽孢桿菌對建鯉生長性能的影響(見表2)

表2 添加3種芽孢桿菌對鯉魚生長性能的影響

投喂3種不同的芽孢桿菌，生長94 d后，結(jié)果表明，與對照組相比，添加0.1%的凝結(jié)芽孢桿菌組特定生長率（SGR）增加了 3.00%（P＜0.05），降低飼料系數(shù)（FCR）5.0%（P＞0.05）。添加0.1%蠟樣芽孢桿菌組的飼料系數(shù)比對照組下降2.50%（P＞0.05），特定生長率(SGR)增加了0.5%（P＞0.05）。而添加0.1%枯草芽孢桿菌組的飼料系數(shù)比對照組顯著增加5.63%（P＜0.05），SGR比對照組顯著降低3.0%（P＜0.05）。

2.2 添加3種芽孢桿菌對鯉魚腸道菌群的影響（見表3）

表3 添加不同芽孢桿菌對鯉魚腸道菌群的影響（lgcfu/g）

在飼料中添加芽孢桿菌后，各試驗組的鯉魚腸道內(nèi)的細菌總數(shù)比對照組增加，其中0.1%蠟樣芽孢桿菌組、0.1%枯草芽孢桿菌組與對照組相比差異顯著 (P＜0.05)。與對照組相比，添加0.1%的凝結(jié)芽孢桿菌使腸道內(nèi)的乳酸菌數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，弧菌及大腸桿菌數(shù)量顯著下降(P＜0.05)，添加0.1%的蠟樣芽孢桿菌使腸道內(nèi)的乳酸菌數(shù)量增加,弧菌數(shù)量下降,但與對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，添加0.1%的枯草芽孢桿菌對腸道內(nèi)的弧菌數(shù)量沒有顯著影響(P＞0.05)，使乳酸菌數(shù)量減少(P＞0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著上升(P＜0.05)。

3 討論

3.1 添加不同芽孢桿菌對鯉魚生長的影響

芽孢桿菌具有較強的分泌胞外酶的能力。休眠的芽孢進入動物消化道后，在適宜的溫度、水分和充足的養(yǎng)分供給下，能萌發(fā)形成營養(yǎng)體，營養(yǎng)體分泌多種酶類。包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及多種非淀粉多糖酶，Kerovuo等成功地從枯草芽孢桿菌中分離出植酸酶基因，并將其在胚芽乳桿菌中進行表達。芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物還包括氨基酸、維生素、有機酸等，這些物質(zhì)能提高飼料的消化吸收率，促進動物的生長。芽孢桿菌的種類比較多，目前允許飼用的芽孢桿菌菌種包括：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、緩慢芽孢桿菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）、東洋芽孢桿菌（Bacillus toyoi）。農(nóng)業(yè)部公布的飼用添加劑目錄中將地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌列為允許在飼料中添加的菌種。水產(chǎn)上關(guān)于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌對動物的生長影響有不少的研究，如華雪銘等在飼料中添加芽孢桿菌提高了暗紋東方鲀（Fasciatus takifugu）幼魚腸道的淀粉酶活性和蛋白質(zhì)合成，促進了生長。劉波等在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)飼料中添加地衣芽孢桿菌增加了腸道消化酶活性，促進了魚體生長。丁賢等用含芽孢桿菌的飼料投喂凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），試驗組凡納濱對蝦的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性均高于對照組。凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)是一種既能產(chǎn)生孢子又能產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽性細菌。由于其特殊的生理特征（能產(chǎn)乳酸），曾經(jīng)被誤命名為芽孢乳桿菌(Lactobacillus sporogenes)，在1939年被更正為凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)。已有研究表明，它能抵抗pH值3.0的酸性環(huán)境，并能忍受0.3%(W/V)的膽汁鹽，因而具有很強的在消化道中生存的能力。在畜禽和水產(chǎn)上有研究表明，在飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌能促進動物的生長、提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用。袁豐華等、付天璽等發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1.0×1012cfu/kg的凝結(jié)芽孢桿菌能顯著促進尖吻鱸、奧尼羅非魚的生長和飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用，滿足最佳生長。但是也有不同的研究表明，飼料中添加芽孢桿菌添加的劑量與動物的生長有一定的關(guān)系，如江萍等對鯉的網(wǎng)箱養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn),飼料中添加0.2%的芽孢桿菌，增重率和餌料系數(shù)下降，而華雪銘等在異育銀鯽的飼料中添加不同濃度的芽孢桿菌對增重有顯著影響，其中添加0.2%的芽孢桿菌組相對增重率比對照組提高33%，但添加0.1%組、0.4%組與對照組相比差異不顯著。

本次試驗中3種不同的芽孢桿菌對鯉魚的生長影響不一致，其中凝結(jié)芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌對鯉魚的生長具有一定的促進作用，但枯草芽孢桿菌沒有表現(xiàn)出促進生長的作用，這可能與菌株的特異性有關(guān)。菌種本身的理化特性是影響微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量和應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。不同的菌種，其理化特性、代謝產(chǎn)物有一定的差異，由此引起的作用效果也不盡相同。趙慶新等對草魚、青魚、白鰱、鳙魚、團頭魴、三角魴、鯉魚和鯽魚等4個亞科魚腸道菌群中的好氧菌或兼性厭氧菌進行了分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一亞科的魚內(nèi)菌群分布有極高的相似性。而不同亞科的魚間菌群分布有較大的差異，哈夫尼亞菌屬、致病桿菌屬、氣單胞菌屬、檸檬酸菌屬、假單胞菌屬在這8種魚中有較高的廣譜系數(shù)(9.893 7～19.017 7),且其x2檢驗不顯著：而鏈球菌屬、拉思氏菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬的廣譜系數(shù)很低，各自只在1種或2種亞科中能檢測到，因此屬于專一性共生菌，芽孢桿菌的數(shù)量級也比較低，只能零星檢出。一般來說，土著菌種的適應(yīng)性、增殖效果、穩(wěn)定性要好于引進的菌種，而市場上的芽孢桿菌產(chǎn)品大多還是從畜禽產(chǎn)品轉(zhuǎn)為水產(chǎn)用，這也可能是本次試驗中所添加的枯草芽孢桿菌沒有促進鯉魚生長的原因之一。

3.2 添加不同的芽孢桿菌對鯉魚腸道菌群的影響

水體中含有大量的細菌，對早期腸道菌群的組成起著決定作用，水體中的細菌組成與魚類腸道內(nèi)定植的細菌群，尤其是原籍菌群，有著某種必然的聯(lián)系。動物腸道固有菌群中，厭氧菌占90%以上，它們構(gòu)成動物腸道的屏障之一，對外界細菌有明顯的拮抗作用。正常條件下，魚腸道內(nèi)的細菌種類和數(shù)量處于動態(tài)的平衡中。環(huán)境惡化、感染疾病、密度過大等因素會破壞這種平衡，使病原菌或條件致病菌異常增殖，從而養(yǎng)殖對象表現(xiàn)出病理狀態(tài)，生長性能下降。芽孢桿菌抗菌的機理在于芽孢桿菌在繁殖過程中消耗腸道內(nèi)的氧,降低腸道上皮細胞膜的氧化還原電勢電位,同時在代謝過程中產(chǎn)生的有機酸如乙酸、丁酸等，這些均能抑制病原菌的生長，而利于厭氧菌的繁殖。有研究表明，在飼料中添加芽孢桿菌能抑制大腸桿菌、弧菌等條件致病菌的數(shù)量，增加乳酸菌等有益菌的數(shù)量。劉波等發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽飼料中添加0.02%的地衣芽孢桿菌，食糜中乳酸桿菌數(shù)量顯著增加，大腸桿菌數(shù)量顯著下降。王鯤等在牙鲆飼料中添加1株魚源芽孢桿菌(克勞氏芽孢桿菌Bacillus clausii)后發(fā)現(xiàn)，其能抑制牙鲆腸道病原菌，有利于改善牙鲆腸道健康。于明超等在凡納濱對蝦飼料中添加芽孢桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對蝦腸道內(nèi)的細菌數(shù)量和組成都有所改變。

在本次試驗中，添加3種芽孢桿菌后腸道食糜中弧菌數(shù)量均有不同程度的下降，添加凝結(jié)芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌后，乳酸菌的數(shù)量有所增加，特別是添加0.1%的凝結(jié)芽孢桿菌后，鯉魚腸道食糜中的乳酸菌數(shù)量比對照組顯著增加，弧菌及大腸桿菌的數(shù)量比對照組顯著下降，這與劉波等的研究結(jié)果是一致的。這表明添加凝結(jié)芽孢桿菌后，使鯉魚腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡較好，從而促進了鯉魚的生長。但試驗結(jié)果表明，添加枯草芽孢桿菌降低了弧菌的數(shù)量，乳酸菌的數(shù)量也有降低的趨勢，這與其顯著降低了魚體的生長呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，具體的原因還有待進一步試驗。

4 小結(jié)

本次試驗發(fā)現(xiàn)，在初始體重為(14.62±0.11)g的建鯉中單獨添加0.1%的枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌對鯉魚的生長和腸道菌群的影響不一樣。添加凝結(jié)芽孢桿菌，可以明顯促進鯉魚生長，顯著抑制腸道內(nèi)弧菌與大腸桿菌，顯著增加腸道內(nèi)的乳酸菌數(shù)量；添加蠟樣芽孢桿菌鯉魚生長有一定的作用，抑制腸道內(nèi)弧菌，增加乳酸菌的數(shù)量，但效果均不顯著；添加枯草芽孢桿菌則抑制了鯉魚的生長，一定程度上降低弧菌的數(shù)量，減少了腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量。由此可見，在鯉魚飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌對鯉魚的生長和腸道健康是有益的，單獨添加枯草芽孢桿菌的效果則有待進一步研究。

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