李雅娟，高 敏，錢 聰，曹頂臣，孫效文

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070）

德國鏡鯉(Cyprinus carpioL.mirror)具有生長速度快、含肉率高、肉質(zhì)好、易捕撈等優(yōu)點(diǎn)，它與黑龍江野鯉、紅鯉等雜交，其雜種后代都表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)[1]。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）是我國常見的一種小型經(jīng)濟(jì)魚類。泥鰍肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)及多種維生素，并具有藥用價(jià)值[2]。泥鰍存在多倍體現(xiàn)象，我國除了二倍體泥鰍外還存在天然三倍體、四倍體泥鰍[3-7]。最近Li等研究表明，我國自然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體，是多倍體育種的良好材料[8-9]。核仁組織區(qū)(Nucleolus organizer region，NOR)是真核細(xì)胞染色體上18s+28s r RNA基因所在的部位，是生產(chǎn)rRNA的場所。用硝酸銀染色法可顯示有活性的Ag-NOR。NOR數(shù)目被認(rèn)為是一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞遺傳學(xué)指標(biāo)。用攜帶有Ag-NORs的染色體作為魚類核型進(jìn)化的指標(biāo)，對(duì)于探討魚類系統(tǒng)發(fā)生具有重要意義。這種方法已在哺乳類和兩棲類等脊椎動(dòng)物獲得廣泛應(yīng)用。自Klingerman等最早對(duì)魚類NOR進(jìn)行分析以來，這方面的研究逐漸增多[10]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，迄今已對(duì)200余種魚的染色體NOR進(jìn)行了分析。國內(nèi)對(duì)于魚類銀染帶的研究起步比較晚，中國具有世界上最為豐富的鯉科魚類[11]，關(guān)于鯉科魚染色體核仁組織區(qū)(NOR)研究也曾有報(bào)道。桂建芳等對(duì)四種鯉科魚類的銀染核型進(jìn)行了研究[12]。王蕊芳等對(duì)鯉魚的一些品種的染色體銀染帶及不同地理區(qū)域鯽魚染色體銀染核仁組織者的進(jìn)行了比較研究[14]。任修海等對(duì)36種鯉科魚染色體核仁組織區(qū)(NOR)研究指出，中國鯉科魚類NOR的基本特征是，2對(duì)NOR存在于亞中部著絲粒染色體上，屬于較特化的類型[15]。楊太有等對(duì)黃河鯉的染色體核型及銀染核型進(jìn)行了研究[16]。鯉科魚類的倍性問題一直是科學(xué)家的研究熱點(diǎn)，據(jù)報(bào)道德國鏡鯉染色體數(shù)目為100[17]，它是具有4套染色體組的遺傳的四倍體（4n=100），還是已經(jīng)二倍化的進(jìn)化的四倍體（2n=100），目前尚未清楚。因此，本文通過對(duì)德國鏡鯉與二倍體泥鰍、四倍體泥鰍的銀染核型進(jìn)行比較分析，旨在為德國鏡鯉和泥鰍的起源提供細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)，并為其遺傳、變異、分類、系統(tǒng)演化以及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚的采集

德國鏡鯉采自黑龍江省呼蘭永興魚場（雌魚22尾，雄魚10尾），暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱，暫養(yǎng)溫度為（22±2）℃。泥鰍采自長江水系湖北省赤壁市，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，暫養(yǎng)溫度（23±1）℃。

1.2 染色體標(biāo)本的制備

每尾魚腹腔注射PHA溶液，劑量為6 μg·g-1（魚體重），18～20 h后進(jìn)行第二次注射PHA（劑量同第一次），作用4～6 h后，活體腹腔注射0.1%秋水仙素，劑量為6 μg·g-1（魚體重），作用2～3 h。剪尾鰭放血5～10 min。分別取鰓、腎組織剪成小塊，置于0.8%的檸檬酸鈉溶液中，室溫低滲40～45 min。再將鰓、腎組織塊移入新配制預(yù)冷的卡諾固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)中，每隔15 min更換一次固定液，重復(fù)3次。加入新的固定液置-20℃冰箱中過夜保存，次日取部分組織塊用50%冰醋酸解離，剪成細(xì)胞懸液，加入新配置卡諾固定液，過濾。采用冷滴片法制備染色體標(biāo)本。

1.3 銀染（Ag-NOR）

采用Howell和Black[18]的快速銀染法。50%硝酸銀與2%明膠（內(nèi)含1%甲酸）以2∶1混勻后滴在染色體標(biāo)本上，加蓋玻片，70℃處理2 min。當(dāng)整張玻片呈棕黃色時(shí)取出，流水沖去蓋玻片，干燥后鏡檢。

1.4 核型分析方法

分別觀察50個(gè)分裂相和100個(gè)細(xì)胞核，以確定Ag-NORs的數(shù)目。選取3～5個(gè)清晰、分散較好的分裂相進(jìn)行顯微拍照，并分別進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。核型分析參照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行，以確定Ag-NORs的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ag-NORs的數(shù)目

Ag-NORs的數(shù)目在中期分裂相及間期核中均表現(xiàn)出不同的多態(tài)性。德國鏡鯉中期分裂相及間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～2個(gè)，含有2個(gè)Ag-NORs的頻率最高，分別為80%、56%（見表1，圖1-A）。二倍體泥鰍中期分裂相及間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～2個(gè)，含有2個(gè)Ag-NORs的頻率最高，分別為72%、60%（見表1，圖1-B）。四倍體泥鰍中期分裂相及間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～4個(gè)，中期分裂相中含有3個(gè)Ag-NORs的頻率最高，為36%（圖1-C），間期核中含有2個(gè)Ag-NORs的頻率最高，為40%（圖1-C，圖1彩版見封三）。

表1 中期分裂相Ag-NORs頻率及間期核中核仁的頻率Table 1 Frequency of Ag-NORs per metaphase and number of nucleolus per interphase nucleu

圖1 德國鏡鯉和不同倍性泥鰍間期核硝酸銀染色Fig.1 Ag-NORs in interphase nuclei from German mirror carp and different ploidy loaches

2.2 Ag-NORs的核型

為了確定攜帶有NOR的染色體在核型中的位置和NORs在染色體上的位置，對(duì)德國鏡鯉和不同倍性泥鰍進(jìn)行銀染核型分析。

2.2.1 德國鏡鯉

2n=100，核型組成為30 m+26 sm+30 st+14 t,NF=156。NOR的染色體在核型中位置和NORs在染色體上的位置是:sm組第8號(hào)染色體的短臂末端（見圖2-A,D，圖2彩版見封三）。

2.2.2 二倍體泥鰍

2n=50，核型組成為10 m+4 sm+36 st,NF=64。NOR的染色體在核型中位置和NORs在染色體上的位置是:m組第1號(hào)染色體的短臂末端（見圖2-B,E）。

2.2.3 四倍體泥鰍

4n=100，核型組成為20 m+8 sm+72 st,NF=128。NOR的染色體在核型中位置和NORs在染色體上的位置是:m組第1號(hào)染色體的短臂末端（見圖2-C,F）。

圖2 德國鏡鯉和不同倍性泥鰍銀染中期分裂相及核型Fig.2 Ag-NORs and Karyotypes in metaphase spreads from German mirror carp and different ploidy loaches

3 討論與結(jié)論

3.1 德國鏡鯉與鯉科魚類銀染核型的比較

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，迄今國內(nèi)已對(duì)50余種鯉科魚的Ag-NORs進(jìn)行分析（見表2），從表2中可以看出，具有4個(gè)Ag-NORs的種類占59%；其次是具有2個(gè)Ag-NORs占25%；具有6個(gè)Ag-NORs占10%；具有8個(gè)Ag-NORs占6%。Ag-NORs染色體的類型是:sm占51%；st占25%；t占13%；m占11%。

表2 目前國內(nèi)已發(fā)表的鯉科魚Ag-NORs資料比較Table 2 The comparison among the currently published Ag-NORs data of Cyprinid fishes in China

續(xù) 表

續(xù) 表

從表2所列舉的銀染資料可以看出，多數(shù)中國鯉科魚類的Ag-NORs數(shù)為4，位于兩對(duì)亞中部著絲點(diǎn)染色體的短臂末端，說明中國鯉科魚類具有較特殊的銀染核型。Amwemiya和Gold[29]等通過對(duì)50余種北美鯉科魚類研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)都具有一對(duì)攜帶NORs的染色體，并指出，具有一對(duì)NORs染色體的類型為鯉科魚類的原始類型。Takai和Ojima根據(jù)對(duì)日本鯉科魚的分析也認(rèn)為,具有一對(duì)較小的NOR是魚類中較基本和原始的性狀[29]。Glod等根據(jù)“普遍性原則”推測(cè)亞端部著絲點(diǎn)染色體短臂上的Ag-NORs為魚類中最原始類型[30]。根據(jù)以上分析,可以認(rèn)為,中國鯉科魚類的原始NOR特征也應(yīng)是一對(duì)NOR、位于端部著絲粒(st或t)染色體短臂末端。本研究發(fā)現(xiàn)，德國鏡鯉具有2個(gè)Ag-NORs,并位于sm染色體上，說明是原始類型。

3.2 德國鏡鯉染色體多倍化

鯉科魚類基本的染色體數(shù)是50或48,這已被大多數(shù)學(xué)者所公認(rèn)。Arai[31]在總結(jié)分析了歐亞大陸已作過核型研究的141種鯉科魚類的基礎(chǔ)上，認(rèn)為2n=50是鯉科魚類最原始的核型，并由2n=50朝幾個(gè)方向演化,即:1.通過非整倍性增加或著絲粒斷裂,由2n=50→52；2.通過著絲粒斷裂,由2n=50或48→78；3.通過多倍化增加,由2n=50→100或98；4.通過羅伯遜易位,由2n=50→48,2n=48→44；5.通過缺失而減少,由2n=48→46。在北美鯉科魚類中90%以上的物種染色體數(shù)目2n=50。據(jù)周暾[32]統(tǒng)計(jì)和咎瑞光[33]報(bào)道，在我國已做過染色體研究的117種鯉科魚類染色體中，2n=50的有49種，占42%，所以眾多學(xué)者公認(rèn)50或48條染色體是鯉科魚類基本的二倍體條數(shù)。這些數(shù)據(jù)說明2n=50的核型是鯉科魚類較原始的核型[23]。近年來,對(duì)鯉科魚類染色體研究比較多，從已有的報(bào)道中發(fā)現(xiàn),染色體數(shù)2n=100廣泛存在于鯉亞科的鯉屬和鯽屬。本研究德國鏡鯉的染色體數(shù)目為100，是50的2倍，這與已作核型分析的中國鯉魚相同。經(jīng)銀染分析，最高銀染點(diǎn)數(shù)代表細(xì)胞染色體的倍性，四倍體泥鰍具有4個(gè)NORs，德國鏡鯉和中國鯉魚均具有2個(gè)NORs，分別分布在sm染色體上，與大多數(shù)的中國鯉科魚類NOR表型一致[15]。四倍體泥鰍無論中期分裂相還是間期核最高銀染數(shù)為4個(gè)。因此，認(rèn)為四倍體泥鰍進(jìn)行加倍后未發(fā)生二倍化或在二倍過程中，而德國鏡鯉與中國鯉魚一樣是多倍化后經(jīng)歷了二倍化過程演變而來，是二倍化的四倍體。本研究結(jié)果可為德國鏡鯉和泥鰍的親緣關(guān)系及起源提供細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)。

[1] 尹洪濱,劉明華,沈俊,孫中武.德國鏡鯉的核型研究[J].生物技術(shù),1995,5(3):16-18.

[2] 劉孝華.泥鰍的生物學(xué)特性及養(yǎng)殖技術(shù)[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué).2008,47(1):93-95.

[3] 李渝成,李康.馬口魚和泥鰍的核型研究兼論魚類染色體數(shù)目多態(tài)與分類的關(guān)系[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),1987,1:107-112.

[4] 李雅娟,印傑,王嘉博,等.中國29の地點(diǎn)ドジョウにおける倍數(shù)體の分布に関する研究[J].日本水産學(xué)會(huì)誌,2008,74(2):177-182.

[5] 李康,李渝成,周暾.兩種泥鰍染色體組型的比較研究[J].動(dòng)物學(xué)研究,1983,4:75-81.

[6] 印杰,趙振山,陳小奇,等.二倍體和四倍體泥鰍染色體組型比較[J].水生生物學(xué)報(bào),2005,4(29):469-472.

[7] 李雅娟,田萍萍,李瑩,等.中國洪湖不同倍性泥鰍的染色體組型及形態(tài)特征比較分析[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(3):236-240.

[8] Li Y J,Tian Y,Zhang M Z,et al.Chromosome banding and FISH with an rDNA probe in the diploid and tetraploid LoachMisgurnus anguillicaudatus[J].IchthyologicalResearch,2010,57(4):358-366.

[9] Li Y J,Yu Z,Zhang M Z,et al.The origin of natural tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus(Teleostei:Cobitidae)inferred from meiotic chromosome configurations[J].Genetica,2011(139):805-811.

[10] Klingerman A D,Bloom S E.Distribution of F-bodies,heterochromatin and nucleolar organizers in genome of central mudminnow[J].Umbra limi Cytogenet Cell Gent,1977,18:182-196.

[11] 伍獻(xiàn)文編.中國鯉科魚類志(下卷)[M].北京:科學(xué)出版社,1977:229-570.

[12] 桂建芳,周暾.四種鯉科魚類和一種鮠科魚類的銀染核型研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),1986(1):106-112.

[13] 王蕊芳,施立明,賀維順.幾種鯉魚染色體核仁組織者的銀染觀察[J].動(dòng)物學(xué)研究,1985,6(4):391-398.

[14] 王蕊芳,施立明,賀維順.不同地理區(qū)域鯽魚染色體銀染核仁組織者的比較研究[J].動(dòng)物學(xué)研究,1988,9(2):165-169.

[15] 任修海,崔建勛,余其興.中國鯉科魚類染色體核仁組織區(qū)研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1996,42(4):475-480.

[16] 楊太有,李仲輝,張西瑞,等.黃河鯉魚核型和銀染核型的研究[J].淡水漁業(yè),1996,26(4):6-8.

[17] 張克儉,何玉明,張景龍,等.德國鏡鯉染色體組型的研究[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999,54(1):72-75.

[18] Howell W,Black M.Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer:A 1-step method[J].Exppeneertia,1980,36:1041-1015.

[19] Levan A,Fredga K,Sandberg A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J].Hereditas,1964,52:201-220.

[20] 周密,康楊,李渝成,等.鯉科七種魚的銀染核型研究[J].動(dòng)物學(xué)研究,1988,9(3):225-229.

[21] 任修海,崔建勛,余其興.六種鯉科魚類核仁組織者區(qū)的研究[J].遺傳,1993,15(4):11-13.

[22] 常重杰,余其興.鯉和鯽銀染核型的比較研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1993(3):110-114.

[23] 任修海,余其興,崔建勛,等.魚類染色體的熒光顯帶研究[J].遺傳學(xué)報(bào),1993,20:116-121.

[24] 常重杰,余其興.七種鲌亞科魚Ag-NORs的比較研究[J].遺傳,1997,19(4):22-25.

[25] Ren Xiuhai,Yu Xianjue.Characterization of nucleolar organizer regions of twelve species of Chinese cyprinid fishes[J].Caryologia,1993,46:201-207.

[26] Ren Xiuhai,Cui Jianxun,Yu Qixing.The heterogeneities of heterochromatins and NORs in the genomes of chinese cyprinid fishes[J].Cytologia,1991,56:673-677.

[27] 陳友鈴,鄭翠芳,吳文珊,等.玫瑰脂鯉和紅鰭銀鯽的核型及銀染和C-帶研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,23(4):96-100.

[28] Amemiya C T,Gold J R.Cytogenetic studies in North American minnows(Cyprinidae),Chromosomal NOR phenotypes of 12 species,with comments on cytosystematic relationships among 50 species[J].Hereditas,1990,112:231-247.

[29] Takai A,Ojima Y.Chromosomal distribution of nucleolus organizer in Japanese cyprinid fish[J].Cytobios,1992,71:7-17.

[30] Gold J R.Silver-staining and heteromorphism of chromosomal nucleolus organizer regions in North American cyprinid fishes[J].Copeia,1984(1):133-139.

[31] Arai R.A chromosome study on two cyprinid fishes,A crossochellusis bistus andPteudorabora pumilswith notes on Eurasian cyprinidae and their karyotypes[J].Bull Sci Mus Tokyo Ser,1982,8(3):131-152.

[32] 周墩.魚類染色體研究[J].動(dòng)物學(xué)研究,1884,5（增刊）:38-52.

[33] 咎瑞光,宋崢,劉萬國,等.七種鲃亞科魚類的染色體組型研究[J].兼論魚類多倍體的判定問題動(dòng)物學(xué)研究,1984,5（增刊）:82-90.