于 敏，曲娟娟，王 征，朱 超

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040）

BALB/C小鼠特別是在單克隆抗體制備及免疫學(xué)試驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，高純度及完整的總RNA提取及純化對(duì)后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)重要。小鼠組織總RNA提取的方法一般采用傳統(tǒng)的高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍或蛋白質(zhì)變性劑十二烷基硫酸鈉以及Invitrogen公司TRIpure商品化試劑盒[1]。傳統(tǒng)提取方法將裂解細(xì)胞的核蛋白體解離，并通過(guò)酸性苯酚使RNA進(jìn)入水相，在離心后使RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離，此類方法成本較低但步驟繁瑣[2]。商品化總RNA提取試劑盒具有方法簡(jiǎn)單、RNA質(zhì)量可靠的優(yōu)點(diǎn)，但RNA產(chǎn)品中常伴有大分子質(zhì)量染色體DNA污染，特別是以復(fù)雜的動(dòng)物組織為原材料時(shí)，這一問題顯得特別突出[3]。商品化的核酸提取試劑盒在該實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域中有廣泛應(yīng)用，一些比較知名的國(guó)外公司，其生產(chǎn)的試劑盒有較高的回收效率，與傳統(tǒng)的核酸提取方法相比，操作更簡(jiǎn)單，更快速，并且大大降低樣品污染的可能性。本試驗(yàn)主要以某公司的TRIzol試劑、氯化鋰和某公司商品化的試劑盒分別提取了BALB/C小鼠心臟、肝臟和腎臟組織的基因組RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值、瓊脂糖凝膠電泳及RT-PCR方法，比較不同方法和組織中提取的RNA質(zhì)量，為后續(xù)的試驗(yàn)工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)，體重20～25 g的雄性健康BALB/C小鼠(購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心)。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒、TRIzol試劑、氯化鋰、氯仿（分析純）乙醇等；離心機(jī)、1.5 mL無(wú)酶離心管、微量移液器及吸頭等。

1.3 組織前處理

BALB/C小鼠饑餓24 h后頸椎脫臼法處死，取出心臟、肝臟和腎臟，放入預(yù)冷的0.8%生理鹽水中漂洗掉多余的血液。分別剪取各組織約0.1 g的組織塊放入預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨。

1.4 TRIzol提取

按100 mg·mL-1的比例加入T試劑，冰上裂解15 min。樣品移入1.5 mL離心管中，4℃12 000 g離心10 min。取離心后的上清，室溫靜置5 min，按每mL TRIzol加200 μL氯仿的比例加入氯仿溶液，顛倒混勻15 s，室溫靜置3 min。4℃12 000 g離心15 min。取樣品離心后的上清，重復(fù)此步。將離心后的上清移入1.5 mL離心管中，加入2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，顛倒混勻，冰浴15 min，4℃12 000 g離心15 min。棄去上清，用75%乙醇漂洗沉淀，并渦旋數(shù)秒，4℃7 500 g離心10 min。棄去上清，室溫干燥沉淀，加入適量DEPC水溶解，-70℃保存。

1.5 RNA kit提取

按60 mg·mL-1的比例加入裂解液15 000 g室溫離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至離心柱中，13 000 g室溫離心3 min。將離心收集的流出液轉(zhuǎn)移到新的EP管中。加入5倍體積的1×buffer ERL（樣品體積不能超過(guò)1 mL），渦旋混勻，冰浴15 min，冰浴時(shí)渦旋數(shù)次。4℃450 g離心10 min，棄去上清，2倍樣品體積的buffer ERL重懸沉淀，4℃450 g離心10 min。完全棄去上清，100 μL DEPC水重懸沉淀，加入350 μL（樣品小于500 μL時(shí)加入350 μL，0.5～1 mL時(shí)加入600 μL）buffer MRC（1 mL MRC加入 20 μL二巰基乙醇，室溫保存2周），再加入等體積70%乙醇，渦旋數(shù)秒。取一RNA結(jié)合柱，放入2 mL收集管中，將樣品全部轉(zhuǎn)移到柱內(nèi)（可以分多次），4 ℃ 10 000 g離心30 s。加入700 μL WBI，4 ℃ 10 000 g離心30 s，換新收集管，加入500 μL WBII，4℃10 000 g離心30 s，重復(fù)此步驟。4℃13 000 g離心2 min（空離），加入適量DEPC水，10 000 g離心1 min。棄去上清，室溫干燥沉淀，加入適量DEPC水溶解，-70℃保存。

1.5 氯化鋰法

按100 mg·mL-1的比例加入氯化鋰-尿素溶液，勻槳器高速勻槳2 min并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中，勻槳液0～4℃放置4h后，12 000 g離心30 min取沉淀，加入原勻槳液0.5體積的氯化鋰-尿素溶液復(fù)溶，重復(fù)上述步驟；加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15～30 min并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4 000 g離心5 min；取上層水相，加1/10倍體積的3 mmol·L-1乙酸鈉（pH 5.2）及2倍體積的乙醇，-20℃放置1 h，5 000 g離心。棄去上清，室溫干燥沉淀，加入適量DEPC水溶解，-70℃保存。

1.6 RNA質(zhì)量檢測(cè)

將2 μL RNA樣品，用Nanodrop定量分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度。計(jì)算A260/280、A260/230的比值。取各組織總RNA樣品0.5 μg，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 小鼠組織總RNA的RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR方法檢測(cè)小鼠組織溶酶體標(biāo)志蛋白的mRNA表達(dá)，用以檢測(cè)所提取的RNA質(zhì)量。將提取的RNA模板8 μL，加入Oligo（dT）15（20 μmol·μL-1）1 μL以及dNTP混合物（各自濃度為2.5 m mol·L-1）4 μL，在65℃溫浴5 min，立即放入冰盒，然后依次加入5×第一鏈緩沖液 4 μL，0.1 mol·L-1DTT 2 μL，40 U·μL-1RNA酶抑制劑0.5 μL，SuperscriptTMII RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）0.5 μL，DEPC水調(diào)終體積為20 μL，混勻，42℃溫浴1 h。此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在70℃滅活15 min后，-20℃保存?zhèn)溆?，也可立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列為:sense 5'CTGGAAGTTTATTCATCTATCA 3',antisense 5'GA ATGTAACCTTGATTG TTATC 3'。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，94℃ 40 s，56℃30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)程序?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物長(zhǎng)度為104 bp，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠組織總RNA的純度檢測(cè)

Nanodrop定量分析儀分析結(jié)果顯示（見表1），提取的小鼠心臟總RNA A260/A280比值介于1.83～1.94之間A260/A230比值介于1.67～2.13之間；提取的小鼠肝臟組織總RNA A260/A280比值介于1.89～1.95之間，A260/A230比值介于2.00～2.14之間；提取的小鼠腎臟組織總RNA A260/A280比值介于1.83～1.97之間，A260/A280比值介于1.91～2.03之間；與其他兩種組織相比，腎臟組織RNA提取效果最好。用氯化鋰提取的總RNA A260/A280比值介于1.83～1.89，A260/A230比值介于1.67～2.14；用TRIzol試劑提取的總RNA A260/A280比值介于 1.94～1.97，A260/A230比值介于 1.93～2.12之間；用試劑盒提取的總RNAA260/A280比值介于1.84～1.90，A260/A230比值介于1.94～2.13之間；與其他兩種方法相比，用TRIzol試劑提取得到的RNA純度較高。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

表1 不同方法提取不同組織RNA的濃度、純度及樣品用量Table1 Concentration,purity and amount of different tissue RNA by different extraction method

肝臟、腎臟和心臟樣品提取的總RNA電泳結(jié)果見圖1，三者比較電泳結(jié)果無(wú)明顯差別。在小鼠肝組織總RNA提取過(guò)程中，兩種方法提取的總RNA產(chǎn)品均為白色或透明狀，說(shuō)明其中有多酚類物質(zhì)基本被全部除去。提取的小鼠不同組織總RNA均可見3條清晰的條帶，分別為5S、18S和28S rRNA，且28S rRNA的亮度為18S rRNA的兩倍，證明所提取的RNA未降解，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 總RNA的RT-PCR檢測(cè)

以上述提取的小鼠肝臟、腎臟和心臟總RNA為樣品，RT-PCR方法擴(kuò)增小鼠主要組織相容性復(fù)合體蛋白H-2K編碼基因。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，3個(gè)樣品均可擴(kuò)增出104 bp的特異性條帶，擴(kuò)增效率較好。說(shuō)明利用本研究各方法提取的小鼠肝臟、腎臟和心臟總RNA質(zhì)量較好，可滿足RT-PCR試驗(yàn)的要求。

圖1 小鼠不同方法提取的不同組織RNA結(jié)果Fig.1 Results of RNA from different tissue of BALB/C mouse by different extration method

圖2 小鼠不同方法提取的不同組織RNA RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of RT-PCR with RNA from different tissue of BALB/C mouse by different extration method

3 討論與結(jié)論

RNA提取過(guò)程中，RNase是主要的降解源，因此所有用到的物質(zhì)都要進(jìn)行去RNase處理，主要方法用DEPC處理，試驗(yàn)整個(gè)過(guò)程須戴一次性手套操作。任廣睦等研究發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腎臟等因富含內(nèi)源性Rnase，即使應(yīng)用電動(dòng)勻漿儀勻漿也不能避免RNA的降解，最好的方法是在液氮條件下將組織研碎，然后再低溫勻漿，且勻漿時(shí)應(yīng)加大裂解液使用量[4]。張宏山等發(fā)現(xiàn)提取小鼠肝、腎組織時(shí)，因其組織塊較大，需要研磨，而RNA容易降解，因此需在低溫下進(jìn)行[5]。本試驗(yàn)選用液氮研磨的方法，而一般的試劑盒都是在室溫下使用的，考慮到低溫使用可能會(huì)影響效果，決定使用TRIzol試劑。TRIzol試劑的特點(diǎn)是在低溫下有良好的裂解效果，能夠充分裂解組織，得到較高濃度的RNA。但是TRIzol試劑有一定毒性，因此在試驗(yàn)過(guò)程中因采取保護(hù)措施。結(jié)果表明在本次試驗(yàn)涉及到的幾種組織中，小鼠肝臟RNA含量最高。

與DNA相比RNA更容易降解，因此在RNA提取過(guò)程中要特別注意溫度及時(shí)間控制，RNA含量較低的樣品提取時(shí)，適量加入一些RNA酶抑制劑[6]。同時(shí)要確保環(huán)境的穩(wěn)定，操作人員應(yīng)使用口罩及一次性手套操作，以確保將環(huán)境中RNase酶的影響降到最低，從而保證RNA提取的質(zhì)量[7]。試驗(yàn)應(yīng)用不同的方法，成功提取BALB/C小鼠不同組織RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)用TRIzol試劑在小鼠腎臟組織中獲得的核酸片段均具有更高的純度及濃度，而1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三種來(lái)源的RNA均具有較好的完整性。RT-PCR方法擴(kuò)增小鼠主要組織相容性復(fù)合體蛋白H-2K編碼基因，3個(gè)樣品均可擴(kuò)增出104 bp特異性條帶。驗(yàn)證各個(gè)方法可行性，為相關(guān)研究提供參考。

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