杜智恒，王慰慰，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

中國(guó)林蛙（Rana chensinensis）作為一種藥用動(dòng)物，其輸卵管的干燥物即林蛙油是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材，具有補(bǔ)血壯體安神、美容養(yǎng)顏抗衰老、補(bǔ)腎延年益壽、平喘潤(rùn)肺抗疲勞等功效。人體衰老是由于體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量自由基而沒(méi)有得到及時(shí)清除引起的，而超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）則是清除這些自由基的重要酶之一[1]，SOD廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，專(zhuān)門(mén)清除生物體內(nèi)超氧陰離子，平衡機(jī)體氧自由基，防止機(jī)體發(fā)生各種生理病變[2-4]。例如由于機(jī)體某些病理或生理（如衰老）原因，常常會(huì)出現(xiàn)因SOD驟減而導(dǎo)致自由基劇增等現(xiàn)象的發(fā)生[5]。目前已發(fā)現(xiàn)林蛙油能夠顯著延長(zhǎng)果蠅平均壽命和最高壽命，其機(jī)制為升高SOD活性，降低過(guò)氧化脂質(zhì)生成[6]。

根據(jù)SOD結(jié)合金屬離子不同，將其分為FeSOD、MnSOD、Cu/ZnSOD、NiSOD、MnFeSOD和Fe/ZnSOD六種類(lèi)型[7]，目前研究較多的是Cu/ZnSOD和MnSOD。MnSOD主要存在原核生物和真核生物線(xiàn)粒體中，在甲殼類(lèi)細(xì)胞質(zhì)中也有存在[8]，而Cu/ZnSOD廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，是集體防御氧化損傷的一種重要金屬酶，能轉(zhuǎn)移性地清除超氧陰離子自由基，在維持氧自由基平衡方面起著重要作用[9]，并且占總SOD的90%。杜金芳等進(jìn)行豬Cu/ZnSOD基因mRNA表達(dá)對(duì)肌肉抗氧化及肉質(zhì)特性影響的研究，結(jié)果表明Cu/ZnSOD基因的mRNA表達(dá)存在品種和組織差異，品種間Cu/ZnSOD基因mRNA的差異表達(dá)通過(guò)影響肌肉中SOD活性，進(jìn)而參與調(diào)控肉質(zhì)特性形成[10]。Yuan等研究豚鼠（Cavia porcellus）不同組織中不同發(fā)育時(shí)期的抗氧化酶基因Cu/ZnSOD和MnSOD mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明青春期豚鼠CuZnSOD mRNA表達(dá)由強(qiáng)至弱順序：肝＞腎＞肺＞脾＞心；MnSOD mRNA表達(dá)在心中最高，其組織特異性表達(dá)順序：心＞腎＞肝＞肺＞脾。說(shuō)明在不同發(fā)育階段Cu/ZnSOD和MnSOD發(fā)揮著不同的作用[11]。

本研究以小鼠為動(dòng)物模型，通過(guò)直接灌胃方法，驗(yàn)證林蛙油抗氧化、抗衰老作用；利用Realtime PCR的方法分析小鼠肝臟組織中與抗氧化相關(guān)基因Cu/ZnSOD時(shí)空表達(dá)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)分組

雌性5周齡鼠和雌性15月齡鼠各120只，分別隨機(jī)分為4組，其中每組各30只，分籠飼養(yǎng)，每籠5只[1]。

1.1.2 林蛙油的處理

本試驗(yàn)所用林蛙油為經(jīng)過(guò)烘焙碾碎的林蛙油細(xì)粉（由哈爾濱大通集團(tuán)有限公司提供），每次灌胃前用豆油稀釋林蛙油細(xì)粉，豆油添加量為每只鼠0.3～0.6 mL。

1.1.3 林蛙油給藥劑量及時(shí)間

根據(jù)人和小鼠用藥劑量的換算方法，小鼠用藥劑量是人用藥劑量的9倍[12]，換算出小鼠每天的用藥劑量應(yīng)為0.45 g·kg-1。本試驗(yàn)共分3個(gè)劑量組，其中低劑量組給藥量為0.45 g·kg-1，中劑量組給藥量為1.35 g·kg-1，高劑量組給藥量為2.25 g·kg-1；最后一組為對(duì)照組，該組小鼠只以豆油灌胃。

給藥時(shí)間為每天1次，連續(xù)45 d。每天下午3點(diǎn)灌胃，試驗(yàn)期每間隔7 d稱(chēng)體重1次。

1.1.4 組織樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所用組織樣品為小鼠肝臟組織，采集時(shí)間分別在灌胃小鼠15、30和45 d時(shí)，通過(guò)屠宰小鼠采集肝臟組織。每次所采集的肝臟組織樣品均置于-80℃冰箱中保存待用，用于提取總RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

每個(gè)樣品取約400 mg肝臟組織放入坩堝，立即倒入液氮進(jìn)行充分研磨，按?；鵕NA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦方法提取總RNA。將經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測(cè)合格的RNA，按照北京天根生物工程公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)要求將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI中檢索小鼠目的基因序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real time PCR引物序列Table1 Real time PCR primers sequence

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)條件

反應(yīng)物組成：共25 μL體系，其中包括：滅菌去離子水，cDNA模板1 μg·μL-1，10× PCR Buffer，dNTP 2.5 mmol·L-1，特異引物10 pm·μL-1，rTaq聚合酶0.5 U·μL-1。反應(yīng)體系為水16.3 μL，Buffer2.5 μL，dNTP2.0 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2.0 μL，rTaq酶0.2 μL。

PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94℃5 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s循環(huán)次數(shù)為35；72℃延伸7 min。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

將同一組織cDNA混合作為標(biāo)準(zhǔn)品，以5×梯度稀釋?zhuān)?-4，5-3，5-2，5-1，1，共 5 個(gè)梯度。引物分別為管家基因GAPDH和SOD基因的引物。每個(gè)基因的每個(gè)梯度做3次重復(fù)。SOD基因在各脅迫處理中表達(dá)的檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均在同一次PCR循環(huán)中進(jìn)行，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品擴(kuò)增的PCR條件的一致性。PCR結(jié)束后，由7500PCR儀所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析，根據(jù)某一基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的線(xiàn)性計(jì)算公式，將該基因在各樣品中的Ct值代入線(xiàn)性公式，得到相對(duì)濃度。同一模板中SOD基因和GAPDH基因相對(duì)濃度比值即為SOD基因的相對(duì)表達(dá)水平。其中，SOD基因在灌胃豆油的對(duì)照組表達(dá)量設(shè)定為1.0。

1.2.4 Real time PCR反應(yīng)條件

按照哈爾濱?；锟萍加邢薰緹晒舛縋CR試劑盒（SYBR Green）說(shuō)明書(shū)操作：

1.50μL標(biāo)準(zhǔn)PCR定量反應(yīng)體系：

2.混勻定量體系，切忌劇烈震蕩。

3.分裝。

4.Real-Time PCR反應(yīng)條件，采用兩步法：

5.將PCR管放入熱循環(huán)儀并啟動(dòng)循環(huán)程序。

6.進(jìn)行PCR產(chǎn)物融解曲線(xiàn)的分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件采用f檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05或P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的分離

獲得小鼠肝臟組織的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，A260/A280比值均為1.8～2.0之間，甲醛凝膠電泳后可清晰見(jiàn)到18S和28S兩條核糖體RNA條帶（見(jiàn)圖1），說(shuō)明本試驗(yàn)肝臟組織在保存和提取過(guò)程中無(wú)明顯RNA降解發(fā)生，總RNA是完整的。

圖1 小鼠肝臟組織總RNA 1%甲醛瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 1%formaldehyde agarose gel electrophoresis analysis of liver total RNA from mice

2.2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)小鼠（BC096440）GAPDH基因和（BC002066.1）SOD基因的DNA序列各設(shè)計(jì)一對(duì)引物，均得到一條特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相一致，大約為108 bp（見(jiàn)圖2）和215 bp（見(jiàn)圖3）。

圖2 引物GAPDH RT-PCR擴(kuò)增片段Fig.2 PCR amplify results of primer GAPDH

圖3 引物SOD RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplify results of primer SOD

2.3 GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

利用Real time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，GAPDH基因在肝臟組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)如圖4、5所示。

圖4 肝臟中GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of GAPDH gene in the liver

圖5 肝臟中GAPDH基因的融解曲線(xiàn)Fig.5 Dissociation curve of GAPDH gene in the liver

2.4 SOD基因在肝臟中的表達(dá)

2.4.1 SOD基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以GAPDH基因作參照，用引物SOD擴(kuò)增，每個(gè)梯度重復(fù)3次。SOD基因在肝組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)見(jiàn)圖6、7。

圖6 肝臟中SOD基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.6 The standard curve of SOD gene in the liver

圖7 肝臟中SOD基因的融解曲線(xiàn)Fig.7 Dissociation curve of SOD gene in the liver

2.4.2 SOD基因在不同齡小鼠肝組織中的表達(dá)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出SOD基因相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)不同劑量林蛙油灌胃后肝組織中SOD基因表達(dá)差異（見(jiàn)圖8、9）。

經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，5周齡鼠灌胃第15天時(shí)0.45 g·kg-1劑量組肝組織中SOD基因表達(dá)量增加，與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），2.25 g·kg-1劑量組SOD基因表達(dá)量有增加的趨勢(shì)，但不顯著；灌胃30和45 d時(shí)，各劑量組與對(duì)照組基本一致，2.25 g·kg-1劑量組有一個(gè)抑制SOD基因表達(dá)的趨勢(shì)。說(shuō)明5周齡鼠灌胃0.45 g·kg-1劑量15 d時(shí)，肝組織中SOD基因表達(dá)量最高（見(jiàn)表2、圖8）。

15月齡鼠灌胃15 d時(shí)，1.35g·kg-1劑量組與對(duì)照組相比肝組織中SOD基因表達(dá)量有增加的趨勢(shì)；灌胃第30天和45天時(shí)1.35 g·kg-1劑量組肝臟SOD基因表達(dá)量增加，與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），其他劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著。因此15月齡鼠在灌胃1.35 g·kg-1劑量30 d時(shí)，肝組織中SOD基因表達(dá)量最高（見(jiàn)表3、圖9）。

表2 SOD基因在不同灌胃劑量組5周齡鼠肝臟組織中的表達(dá)量Table2 SOD genes expression with different amounts of gastric lavagethe in youth rat liver

圖8 SOD基因在不同灌胃劑量組5周齡鼠肝臟組織中表達(dá)量的變化Fig.8 Volume changes of SOD gene fed the liver tissue in the different dose groups of young rats

表3 SOD基因在不同灌胃劑量組15月齡鼠肝臟組織中的表達(dá)量Table3 SOD genes expression with different amounts of gastric lavagethe in old rat liver

圖9 SOD基因在不同灌胃劑量組老年鼠肝臟組織中表達(dá)量的變化Fig.9 Volume changes of SOD gene fed the liver tissue in the different dose groups of old rats

3 討論與結(jié)論

據(jù)研究，一定劑量林蛙油可以增加卵巢、紅細(xì)胞及血清中SOD活性，降低肝臟及腦組織中MDA含量[13]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠灌胃不同劑量的林蛙油，檢測(cè)其肝組織中Cu/ZnSOD基因的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，5周齡組和15月齡組小鼠灌胃林蛙油后，肝組織中Cu/ZnSOD基因表達(dá)量顯著增加，但總體上看，5周齡鼠0.45 g·kg-1劑量組Cu/ZnSOD基因表達(dá)增加量要普遍高于2.25 g·kg-1劑量組，但與1.35 g·kg-1劑量組差異不顯著；而15月齡鼠1.35 g·kg-1劑量組Cu/ZnSOD基因表達(dá)增加量要顯著高于0.45 和2.25 g·kg-1劑量組，但0.45和2.25 g·kg-1劑量組差異不顯著；15月齡組Cu/ZnSOD基因表達(dá)量升高的速度較慢，一般在灌胃第30天或第45天才出現(xiàn)顯著差異。高濃度與低濃度林蛙油對(duì)Cu/ZnSOD基因表達(dá)影響的差異，可能是由于過(guò)高濃度的林蛙油已經(jīng)超過(guò)了小鼠身體所能接受的極限值，從而引起機(jī)體的一些不適反應(yīng)，對(duì)目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄有一定的抑制作用。并且15月齡鼠與5周齡鼠相比，體內(nèi)SOD酶活性已經(jīng)降低、SOD基因表達(dá)量亦下降，林蛙油的活性物質(zhì)作用于靶器官時(shí)對(duì)自由基造成的損傷需要時(shí)間修復(fù)，因此15月齡鼠的Cu/ZnSOD基因表達(dá)量上調(diào)緩慢。表明SOD在衰老過(guò)程中扮演著重要角色。Orr曾將Cu/ZnSOD基因?qū)牍?，?dǎo)致轉(zhuǎn)基因株具有多個(gè)復(fù)制的Cu/ZnSOD基因，從而壽命比野生型長(zhǎng)1/3[14]。另外，2004年王春花研究發(fā)現(xiàn)，不同月齡快速老化模型鼠肝細(xì)胞中Cu/ZnSOD基因表達(dá)隨年齡的增加其mRNA的表達(dá)量具有明顯的下降趨勢(shì)（P＜0.01）[15]。

本研究證明林蛙油具有明顯的抗氧化抗衰老作用。在衰老過(guò)程中SOD基因隨年齡的增長(zhǎng)，其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。其機(jī)制是自由基直接與核酸反應(yīng)引起RNA主鏈斷裂，堿基降解及氫鏈破壞，對(duì)熱的穩(wěn)定性發(fā)生改變。由于MDA引起交聯(lián)，使遺傳物質(zhì)破壞，從而影響傳遞信息的功能以及轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的特性，導(dǎo)致以mRNA為直接模板的蛋白質(zhì)合成能力下降并產(chǎn)生合成差錯(cuò)，從而引起酶的減少和失活。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨發(fā)展，衰老機(jī)制的研究達(dá)到基因水平，本研究為從分子水平上闡明抗氧化抗衰老作用機(jī)制奠定初步理論基礎(chǔ)。

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