陳 凝， 劉寶瑞

紫杉醇是從短葉紅豆杉樹皮中提取和純化得到的一種對許多類型的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的提取物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是紫杉烷類中一種四環(huán)二萜類化合物。其通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞微管蛋白、停止有絲分裂過程而中斷細(xì)胞的生長，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［1-2］。紫杉醇難溶于水，目前紫杉醇注射劑多以聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇(1∶1)輔助溶劑增加水溶性，前者有促進(jìn)組胺釋放的作用，常引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，臨床使用前需給予抗過敏藥物并進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，且需緩慢滴注。采用脂質(zhì)體為載體，既解決了紫杉醇難溶于水的問題，又因不再使用聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇為溶媒而避免了對人體的毒性反應(yīng)和過敏反應(yīng)［3-4］。

脂質(zhì)體皮下注射后表現(xiàn)出良好的淋巴靶向性和緩釋性［5-7］。直徑小于100 nm的脂質(zhì)體能直接進(jìn)入淋巴管，然后到達(dá)區(qū)域淋巴結(jié)，淋巴吸收可達(dá)70%左右;直徑較大的脂質(zhì)體則沉積在注射部位，逐漸降解后，被其包封的藥物緩慢釋放進(jìn)入血液循環(huán)(見圖1)。

圖1 脂質(zhì)體皮下給藥后藥物分布示意圖

游離藥物瘤體內(nèi)注射后，由于分子粒徑小，藥物容易從注射部位泄漏;而包裹了化療藥物的脂質(zhì)體瘤體內(nèi)注射后，由于分子粒徑較大可以在腫瘤局部維持較高的藥物濃度并緩慢解放，繼而減少全身副作用［8］。用99m锝標(biāo)記的脂質(zhì)體瘤體內(nèi)直接注射后瘤體和瘤周的濃度可達(dá)給藥總量的50%左右，20 h后瘤體和瘤周的濃度仍有給藥總量的40%，而未經(jīng)脂質(zhì)體包裹的99m锝在瘤內(nèi)注射20 h后瘤體和瘤周的濃度只有給藥總量的19%［9］。已有試驗(yàn)證明瘤體內(nèi)直接注射IL-2質(zhì)粒DNA/陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物可抑制小鼠肝癌的生長［10］，而紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)注射后對于腫瘤的控制作用國內(nèi)尚未有報(bào)道，據(jù)此，我們制備了紫杉醇脂質(zhì)體，并觀察其對昆明鼠瘤體內(nèi)給藥后的療效。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 大豆磷脂(北京海淀區(qū)生物科技公司)，膽固醇(北京海淀區(qū)生物科技公司)，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPE-PEG2000，西安力邦制藥有限公司)，紫杉醇注射液(北京四環(huán)制藥有限公司)，紫杉醇原藥(北京協(xié)和藥廠饋贈)，維生素E注射液(上海市第九制藥廠)，小牛血清(Amersco，美國)，胎牛血清(Amersco，美國)，1640培養(yǎng)液(Gibco，美國)，二甲基亞砜(DMSO)、甲醇、二氯甲烷、乙睛均為分析純(上海中興化學(xué)品有限公司)。

JY92-II型超聲波粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，透析袋(8 000，12 000-14 000，Sorua，德國)，超濾膜(Ultracel PL，10.000 NMWL，Millipore，美國)。85-2型恒溫磁力攪拌器(常州國華儀器廠)，2XE-1真空泵(奉化市飛馬電機(jī)廠)，冷凍干燥機(jī)(上海儀表集團(tuán))，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，超濾器(Stirred Cells 8050，Millipore，美國)，UV3100 紫外分光光度計(jì)(Shimadzu，日本)，恒溫槽(ELLY4，TOKYO Rikaaikai，日本)，Zetasizer 3000激光粒徑散射儀(MALVERN，英國)，LC29A高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)，SPD210AVP紫外可變波長檢測器(Shimadzu，日本)。

1.2 動物 昆明種小鼠，體重(20±2)g，雄性，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 小鼠移植瘤株 小鼠 S180細(xì)胞株從中國藥科大學(xué)藥物研究室取種后種植在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物房昆明鼠體內(nèi)傳代。

1.4 紫杉醇脂質(zhì)體的制備及檢測 采用逆向蒸發(fā)法+超聲法制備紫杉醇脂質(zhì)體。經(jīng)粒徑測定儀測定脂質(zhì)體平均粒徑為(282.4±8.94)nm，多分散性為0.243。紫杉醇脂質(zhì)體的包封率為91%［11］。

1.5 實(shí)體瘤模型的建立 選用雄性成熟昆明種小鼠20只，分別在其右后肢近腹側(cè)皮下種植S180細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)1×107/mL)0.1 mL。7天后100%成瘤。

1.6 給藥方法 20只雄性昆明種小鼠皮下種植S180細(xì)胞，7天成瘤后隨機(jī)分為4組，每組5只，分別為生理鹽水對照組、空白脂質(zhì)體組、紫杉醇注射液組、紫杉醇脂質(zhì)體組。紫杉醇注射液、紫杉醇脂質(zhì)體均用生理鹽水稀釋至含紫杉醇劑量1 mg/mL。紫杉醇注射液組、紫杉醇脂質(zhì)體組給藥劑量為10 mg/kg，生理鹽水對照組、空白脂質(zhì)體組為等容積量生理鹽水和等容積量空白脂質(zhì)體懸液，分別瘤體內(nèi)注射，給藥時間為隨機(jī)分組后第0、3、6、9天。每次給藥后觀察小鼠的精神狀況、毛色、活動度，同時測量瘤徑，稱重。在給藥結(jié)束后觀察3天，第4天經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢取血，隨即處死動物，解剖剝離腫瘤，測量瘤徑，計(jì)算瘤體積并稱重。部分血樣進(jìn)行細(xì)胞分類檢查，部分血樣離心后取上清用于肝功能檢測。根據(jù)以下公式計(jì)算抑瘤率:腫瘤抑瘤率=［1－給藥組平均瘤重(體積)/對照組平均瘤重］×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析。采用Stata 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05時為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 荷瘤鼠在給藥期間及觀察期內(nèi)無毛色發(fā)暗、脫毛等改變;給藥期間均存活，活動均自如。給藥后體重均有增加。從動物體重變化可以看出，紫杉醇脂質(zhì)體組給藥前后動物體重增長較紫杉醇注射液組更接近生理鹽水對照組(見表1)。

表1 荷瘤鼠體重的變化(g，±s)

表1 荷瘤鼠體重的變化(g，±s)

注:*12 d與對照組比較P＞0.05，#12 d與對照組比較P＜0.05，△12 d與對照組比較P＞0.05;12 d紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組比較，P＜0.05;12 d紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組比較，P＞0.05。

0 d 3 d 6 d 9 d 12 d P 值1 38.41 ±9.13空白脂質(zhì)體組 21.20 ±2.63 24.13 ±3.22 29.21 ±4.11 34.22 ±6.01 39.00 ±8.05 ＞0.05*紫杉醇注射液組(10 mg/kg) 21.32 ±2.26 23.74 ±2.97 27.32 ±3.77 30.41 ±5.27 33.52 ±6.15 ＜0.05#紫杉醇脂質(zhì)體組(10 mg/kg) 20.81 ±2.45 23.80 ±3.18 29.14 ±5.01 33.83 ±6.92 38.41 ±7.98 ＞0.05生理鹽水對照組 20.71 ±2.51 23.91 ±3.11 28.60 ±5.21 33.70 ±7.8△

2.2 紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥的抑瘤效果 從表2可以看出，與生理鹽水對照組比較，紫杉醇注射液組的質(zhì)量抑瘤率為36.42%(P＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的質(zhì)量抑瘤率為57.47%(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組的質(zhì)量抑瘤率為2.59%(P＞0.05);空白脂質(zhì)體組與紫杉醇脂質(zhì)體組比較，P＜0.01。紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射組比較，P＜0.05。從表3可以看出，與生理鹽水對照組比較，紫杉醇注射液組的體積抑瘤率為(47.55 ±3.12)%(P ＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的體積抑瘤率為(65.49±4.53)%(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組的體積抑瘤率為(3.65±0.62)%(P＞0.05);空白脂質(zhì)體組與紫杉醇脂質(zhì)體組比較，P＜0.01。紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射組比較，P＜0.05。紫杉醇脂質(zhì)體組的抑瘤效果優(yōu)于紫杉醇注射液組。瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠體積變化曲線見圖2。瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠解剖后瘤體標(biāo)本照片見圖3。

表2 荷瘤鼠移植瘤質(zhì)量抑瘤率(%)

表3 荷瘤鼠移植瘤體積抑瘤率(%，±s)

表3 荷瘤鼠移植瘤體積抑瘤率(%，±s)

注:* ，#，△ 均為與對照組比較結(jié)果;紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組比較，P＜0.05;紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組比較，P＜0.01。

動物數(shù)(只) 死亡數(shù)(只) 瘤體積(mm3，±s)前后腫瘤體積抑制率(%) P值生理鹽水對照組 5 0 175±8.45 2 162±123.40空白脂質(zhì)體組 5 0 169±7.98 2 083±135.80 3.65±0.62 ＞0.05*紫杉醇注射液組(10 mg/kg) 5 0 180 ±8.21 1 134 ±78.20 47.55 ±3.12 ＜0.05#紫杉醇脂質(zhì)體組(10 mg/kg) 5 0 178 ±8.53 746 ±61.40 65.49 ±4.53 ＜0.01△

圖2 瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠腫瘤體積變化曲線

2.3 紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠外周血分類改變 從表4可以看出，與生理鹽水對照組比較，紫杉醇注射液組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低(P＜0.05)，血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)無明顯差異(P＞0.05);與生理鹽水對照組比較，紫杉醇脂質(zhì)體組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)略低于生理鹽水對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)與生理鹽水對照組比較無明顯差異(P＞0.05);紫杉醇注射液組比較與紫杉醇脂質(zhì)體組比較，前者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于后者(P＜0.05)。

圖3 瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠解剖后腫瘤體積變化圖片

表4 荷瘤鼠外周血分類檢查結(jié)果

2.4 紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠肝功能檢查結(jié)果 從表5可以看出，與生理鹽水對照組比較，紫杉醇注射液組及紫杉醇脂質(zhì)體組ALT、AST值均略高于生理鹽水對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組間比較以及紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組間比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表5 荷瘤鼠肝功能檢查結(jié)果(mol/L，±s)

表5 荷瘤鼠肝功能檢查結(jié)果(mol/L，±s)

注:*，#，△均為與對照組比較的結(jié)果;紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組比較，紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組比較，均P＞0.05。

ALT(mol/L) P值 AST(mol/L) P值生理鹽水對照組 60.87 ±6.91 71.67 ±5.82空白脂質(zhì)體組 62.31±7.36 ＞0.05* 70.54±6.91 ＞0.05*紫杉醇注射組(10 mg/kg) 72.64±10.25 ＞0.05# 76.97±11.07 ＞0.05#紫杉醇脂質(zhì)組(10 mg/kg) 73.77±9.74 ＞0.05△ 75.55±9.43 ＞0.05△

3 討論

傳統(tǒng)的化療藥物是通過各種途徑給藥后，達(dá)到一定的血藥濃度分布于全身而產(chǎn)生治療作用。這種治療方法最大的缺陷是缺乏選擇性。而脂質(zhì)體對腫瘤組織具有靶向性和緩釋性，在腫瘤組織中能保持較高的藥物濃度，將抗腫瘤藥物選擇性地分布于腫瘤病變部位，降低其對正常組織的毒副作用，從而提高藥物利用率［12-15］。

在對鼠S180實(shí)體瘤模型瘤體內(nèi)給藥中，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對照組比較，紫杉醇注射液組的質(zhì)量抑瘤率為36.42%(P＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的質(zhì)量抑瘤率為57.47%(P＜0.01);與生理鹽水對照組比較，紫杉醇注射液組的體積抑瘤率為(47.55±3.12)%(P ＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的體積抑瘤率為(65.49 ±4.53)%(P ＜0.01)。結(jié)果表明，從抑制腫瘤質(zhì)量及腫瘤體積兩方面統(tǒng)計(jì)，紫杉醇脂質(zhì)體的效果優(yōu)于紫杉醇注射液，其可能的原因在于脂質(zhì)體瘤體內(nèi)注射后，在瘤體和瘤周可以保持長時間的高濃度，從而抑制腫瘤的生長;另一方面，由于脂質(zhì)膜的特異性作用，紫杉醇可以穩(wěn)定停留并蓄積于腫瘤組織處，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)揮細(xì)胞毒作用。我們在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，紫杉醇脂質(zhì)體對于荷瘤鼠外周血白細(xì)胞的毒性小于紫杉醇注射液，這可能與紫杉醇脂質(zhì)體中藥物多集中于瘤組織內(nèi)或瘤周組織，進(jìn)入全身血液循環(huán)相對較少有關(guān)。周衛(wèi)等［16］研究紫杉醇脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的組織分布情況，發(fā)現(xiàn)紫杉醇脂質(zhì)體在肝臟、肺、脾臟等組織中分布較多?？紤]到紫杉醇脂質(zhì)體可能造成的器官毒性，本實(shí)驗(yàn)比較了各組的主要肝功能指標(biāo)。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)所用的劑量下，紫杉醇脂質(zhì)體組的小鼠肝功能與對照組比較無顯著性差異，與紫杉醇注射液組之間也未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。紫杉醇脂質(zhì)體在體內(nèi)分布的改變并未增加其對肝臟的毒性。

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