呂南千，費(fèi) 青，張麒云，樓國祥

骨肉瘤好發(fā)于青少年，惡性程度高、侵襲力強(qiáng)，極易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移[1]，早期肺部轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步及其在腫瘤病因?qū)W的廣泛應(yīng)用，從分子水平研究骨肉瘤的形成機(jī)制，尋找有針對(duì)性的治療措施以改善患者的預(yù)后，漸成骨腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示，作為趨化因子CXCL12，即基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell derived factor 1，SDF 1）的專屬受體，CXCR4與其配體CXCL12相互作用可促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。有研究結(jié)果顯示，包括卵巢癌、肺癌、黑色素瘤等在內(nèi)的多種腫瘤均存在CXCR4的選擇性高表達(dá)[3-4]。但是，CXCR4與骨肉瘤之間的關(guān)系目前尚未明確。為進(jìn)一步深入探討CXCR4與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究在mRNA水平上檢測(cè)多種人骨肉瘤細(xì)胞株CXCR4的表達(dá)情況，并將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/CXCR4通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞HOS-8603中，旨在觀察pcDNA3/CXCR4的表達(dá)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

人骨肉瘤細(xì)胞株HOS-8603、U2OS和MG-63由第二軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中。pcDNA3空白質(zhì)粒和pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒由德國Marburg實(shí)驗(yàn)室Herbert Schwarz教授惠贈(zèng)。穿膜小室（Transwell小室，周徑24 mm、孔徑8 μm）、重組細(xì)胞基底膜（Matrige 1，美國Costar公司）；新生牛血清（美國Hyclone公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）；rTaq酶、T4DNA連接酶、dNTPs及各種限制性內(nèi)切酶（日本TaKaRa公司）；質(zhì)粒小量抽提試劑盒及大量抽提試劑盒（德國Qiagen公司）；Real time PCR試劑（美國Gene公司）；DMSO和MTT（美國Amresco公司）。2550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀和MRC 1024LCSM流式細(xì)胞儀（美國BIO-RAD公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Forma公司）。所有引物采用Primer 2.0軟件自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，CXCR4引物（上游：GAA CTT CCT ATG CAA GGC AGT，下游：CCA TGA TGT GCT GAAACT GGA，長(zhǎng)度：800 bp）；β-actin引物（上游：ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG，下游：CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGATCC ACATCT，長(zhǎng)度：750 bp）。DNA測(cè)序由上海博尚生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR測(cè)定CXCR4 mRNA含量Trizol試劑抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及吸光度（optical density，OD）值。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取1 μg總RNA，加入Oligo（dT）18（500 μg/mL）1 μL，DEPC 水補(bǔ)足至12 μL，70℃加熱5 min后置于冰上，加入5×酶緩沖液4 μL、dNTP（10 mmol/L）2 μL、RNA酶抑制劑（40U/μL）1 μL后混勻，37 ℃溫育5 min；再加入反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，42 ℃溫育 60 min；最后70℃加熱10 min，收集反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。反應(yīng)體系：模板(骨肉瘤cDNA)1 μL、CXCR4引物（5 μ mol/L）l μL、SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，加 ddH2O 水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性，15 min；94 ℃變性，15 s；56 ℃復(fù)性，30 s；72 ℃延伸，30 s；共35個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：熒光本底信號(hào)設(shè)定為前16個(gè)循環(huán)的熒光值；閾值設(shè)定為5～16個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍；Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，實(shí)時(shí)測(cè)定每個(gè)孔的熒光數(shù)值；以β-actin作為內(nèi)參照，校正每個(gè)樣品的Ct值?！鳌鰿t=（樣品Ct均值－內(nèi)參照Ct均值）－（對(duì)照樣品Ct均值－對(duì)照內(nèi)參照Ct均值），然后計(jì)算2-△△Ct，即代表被檢樣品初始mRNA的含量。

1.2.2 PCR鑒定CXCR4重組質(zhì)粒菌落 分別取1 μL pcDNA3空質(zhì)粒和pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒加入感受態(tài)TG1菌液中，依次冰浴30 min、42℃90 s、冰浴5 min，加入800 μL無抗性LB培養(yǎng)液，37℃搖床中100 r/min振搖1 h。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)板上，倒置于37%溫箱中培養(yǎng)過夜；再挑選1個(gè)單克隆菌落加入4 mL LB培養(yǎng)液，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取l μL菌液作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系：菌液1 μL、CXCR4引物1 μL、ddNTP（2.5 mmoL/L）2 μL、10 × buffer 2 μL、rTaq酶 0.1 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性，10 min；95℃變性，30 s；60 ℃退火，45 s；72 ℃延伸，1 min；共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取l μL擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠，凝膠成像系統(tǒng)成像觀察條帶。

1.2.3 雙酶切鑒定CXCR4重組質(zhì)粒 采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提菌液中的重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切反應(yīng)體系如下：EcoR I 1 μL、BamH I 1μL、10 × K buffer 2 μL、質(zhì)粒5 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，37℃酶切3 h。取1 μL酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠，凝膠成像系統(tǒng)成像觀察條帶。

1.2.4 測(cè)序及序列分析 取5 μL經(jīng)PCR和雙酶切鑒定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并運(yùn)用PubMed的BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HOS-8603細(xì)胞 根據(jù)Qiagen質(zhì)粒大量抽提試劑盒說明書進(jìn)行pcDNA3和pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒抽提。應(yīng)用Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HOS-8603細(xì)胞（pcDNA3/CXCR4組）。同時(shí)制備轉(zhuǎn)染pcDNA3空質(zhì)粒的陰性對(duì)照組（pcDNA3組）。轉(zhuǎn)染后24 h和48 h，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)CXCR4轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 MTT法檢測(cè)CXCR4轉(zhuǎn)染后HOS-8603細(xì)胞增殖情況 按l×104/孔將HOS-8603細(xì)胞接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h進(jìn)行MTT反應(yīng)，即每孔加入MTT溶液20 μL培育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處的OD值，每組重復(fù)3次。

1.2.7 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCR4轉(zhuǎn)染后HOS-8603細(xì)胞遷移情況 將HOS-8603細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，按1.5×106/孔接種于Transwell小室，培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，PBS沖洗后用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細(xì)胞，95%乙醇固定微孔膜下層細(xì)胞，HE染色，在400倍高倍鏡下取10個(gè)視野的均數(shù)作為該樣本從微孔膜上層遷移至下層的細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞株中CXCR4 mRNA表達(dá)量差異

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MG-63、U2OS、HOS-8603細(xì)胞中CXCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)含量分別為（12.5±1.6）%、（5.7±1.3）%、（1.1±0.3）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.345，P=0.006）。因此，本研究選擇自身CXCR4表達(dá)較低的HOS-8603細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CXCR4重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)菌TG1并經(jīng)抗生素篩選培養(yǎng)后，取6個(gè)菌落進(jìn)行PCR及電泳成像，可見800 bp左右處有一清晰條帶，與CXCR4條帶大小吻合（圖1A）。雙酶切鑒定結(jié)果：pcDNA3空質(zhì)粒表現(xiàn)出1個(gè)條帶，大小在2000 bp以上；CXCR4重組質(zhì)粒表現(xiàn)出2個(gè)條帶，其中一條在2000 bp以上；另一條在800 bp左右，與CXCR4條帶大小相吻合（圖1B）。pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與PubMed基因庫比對(duì)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中CXCR4 mRNA及其編碼氨基酸序列完全正確。

2.3 RT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果

pcDNA3組CXCR4 mRNA表達(dá)量為（1.03±0.09）%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HOS-8603細(xì)胞24、48 h后，CXCR4基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功且轉(zhuǎn)染效率較高，pcDNA3/CXCR4組的CXCR4 mRNA表達(dá)量分別為（98.43±6.68）%、（138.00±9.21）%，是pcDNA3組的96倍和124倍（P＜0.05）。

2.4 CXCR4轉(zhuǎn)染對(duì)HOS-8603細(xì)胞增殖的影響

pcDNA3組HOS-8603細(xì)胞增殖率為（1.5±0.3）%；pcDNA3/CXCR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24、48、72 h后細(xì)胞增殖率分別為（12.7±3.6）、（34.6±4.7）、（61.5±11.1）%，是pcDNA3組的12.3倍、32.7倍和57.0倍（P＜0.05）；轉(zhuǎn) 染 72 h后 CXCR4對(duì)HOS-8603細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)。見圖2。

2.5 CXCR4轉(zhuǎn)染對(duì)HOS-8603細(xì)胞遷移的影響

pcDNA3組和pcDNA3/CXCR4組遷移的HOS-8603細(xì)胞數(shù)分別為（236±23）、（584±42.9）個(gè)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.092，P=0.000）。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR與雙酶切鑒定結(jié)果

圖2 CXCR4轉(zhuǎn)染對(duì)HOS-8603細(xì)胞增殖的影響

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過程，受許多基因的共同調(diào)控[5]。目前，趨化因子及其受體在腫瘤疾病中的作用也得到了廣泛的關(guān)注和研究。根據(jù)氨基酸序列可將趨化因子受體分為4種類型，即CR、CCR、CXCR和CX3CR。既往的研究結(jié)果顯示，白細(xì)胞對(duì)某種特殊趨化因子的反應(yīng)能力依賴于其細(xì)胞表面所表達(dá)的趨化因子受體，在趨化因子受體作用下，白細(xì)胞向趨化因子所在部位進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，參與炎癥的發(fā)展過程[6]。近年來，研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞表面亦可表達(dá)趨化因子受體，包括CXCR4、CXCR3、CCR10、CCR9、CCR7、CCR4和CCR3等[7]，這些受體和靶器官表達(dá)的趨化因子決定了腫瘤細(xì)胞遷移的方式[8]，參與腫瘤的發(fā)病、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，CXCR4生物軸具有趨化腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)血管生長(zhǎng)的功能，在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[9-11]，CXCL12在淋巴結(jié)、肺和肝臟等組織中高度表達(dá)，而表達(dá)CXCR4的腫瘤則常常轉(zhuǎn)移到上述這些部位[12-13]。Salvucci等[6]的研究結(jié)果表明，通過抗CXCL12-CXCR抗體阻斷CXCL12-CXCR4的功能，或者RNAi技術(shù)使CXCL12-CXCR4基因沉默，可抑制血管生長(zhǎng)因子依賴性的血管生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這說明CXCR4生物軸可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

骨肉瘤作為一種預(yù)后極差的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，缺乏有效的生物標(biāo)志物和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，臨床治療效果并不理想。有研究結(jié)果表明，CXCR4與骨肉瘤的發(fā)生可能也具有密切關(guān)系[14]，進(jìn)一步闡明二者之間的相關(guān)性，有助于為骨肉瘤的治療提供一個(gè)新的切入點(diǎn)，通過針對(duì)性調(diào)控CXCR4的表達(dá)，或與目前常規(guī)采用的放化療、熱療等方式相結(jié)合，有望達(dá)到提高療效，改善患者生存質(zhì)量的目的。

本研究利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)3種人骨肉瘤株（U2OS、MG-63和HOS-8603）中 CXCR4 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在不同分化程度的骨肉瘤細(xì)胞中，CXCR4 mRNA表達(dá)水平的差異很大，其中在低分化骨肉瘤細(xì)胞MG-63中表達(dá)量相對(duì)較高，在中分化骨肉瘤細(xì)胞U2OS中表達(dá)量相對(duì)較低，而在高分化的骨肉瘤細(xì)胞HOS-8603中的表達(dá)量最低，因此，本研究選擇HOS-8603細(xì)胞作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。上述結(jié)果也提示CXCR4的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化有一定關(guān)系，但其具體相關(guān)性仍有待進(jìn)一步探討。

本研究將重組的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/CXCR4轉(zhuǎn)染入HOS-8603細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的HOS-8603細(xì)胞CXCR4表達(dá)明顯增加，同時(shí)骨肉瘤細(xì)胞增殖明顯增加，這與有關(guān)學(xué)者報(bào)道的CXCR4促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的現(xiàn)象一致[15-18]。另外，本研究中遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，CXCR4能夠明顯促進(jìn)HOS-8603細(xì)胞遷移。這提示CXCR4可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的成瘤性，加速腫瘤的生長(zhǎng)，并可能參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這也為進(jìn)一步在體實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)，為骨肉瘤的分子生物學(xué)治療提供了新的思路。

綜上所述，CXCR4的表達(dá)與骨肉瘤細(xì)胞株不同的分化程度密切相關(guān)，恢復(fù)其表達(dá)可明顯促進(jìn)骨肉瘤的增殖和遷移，這進(jìn)一步證實(shí)CXCR4可能在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，有可能成為骨肉瘤預(yù)防和治療中一個(gè)新的靶點(diǎn)。為進(jìn)一步闡明CXCR4對(duì)骨肉瘤的影響，我們將在以后的工作中進(jìn)一步完善CXCR4表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理特征之間的相關(guān)性研究，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察CXCR4基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨肉瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及成瘤能力的影響。

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