孫 波 周 悅 劉紅建 周慶偉 (吉林大學藥學院，吉林 長春 3002)

目前對腫瘤患者常見的化療和放療手段往往導致嚴重的副作用，因此尋找高效、低毒的抗腫瘤新藥是近幾年來研究的熱點之一。小分子多肽廣泛存在自然界，并可通過人工方法合成，由于其具有分子量小、活性高、毒性低等特點〔1〕。這些腫瘤抑制肽主要是通過直接抑制腫瘤生長作用、抑制腫瘤新生血管生成、激活機體免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔3～5〕，在腫瘤的臨床治療上有重要價值。本研究基于目前國內(nèi)外研究進展，設(shè)計、合成新的雜合肽是由血小板反應(yīng)蛋白-1和血管抑素的血管生成抑制同源區(qū)域以串聯(lián)方式連接而成的。通過體內(nèi)外實驗觀察，證實了新的雜合肽具有明顯抑制Lewis腫瘤細胞的增殖、遷移，在體內(nèi)能夠抑制堿燒傷后兔角膜新生血管以及對C57BL/6N純系小鼠腫瘤血管生成的抑制作用，并在細胞水平和整體水平上研究結(jié)果具有一定相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6N及新西蘭大白兔雌雄各半(由吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心提供);細胞株(上海細胞研究所提供)，IMDM培養(yǎng)基、新生胎牛血清(美國GIBCO公司);細胞株(上海細胞研究所);IMDM培養(yǎng)基、新生胎牛血清(美國GIBCO公司);多肽合成儀ACT90(日本ACT公司);Flash中壓純化系統(tǒng)(Biotaga SPI，美國);制備型高效液相色譜儀(Waters Delta Prep400，美國Waters公司);質(zhì)譜儀電噴霧質(zhì)譜(FINNIGANMATLCQ，美國 FINNIGAN公司);冷凍干燥機(德國CHRIST公司);裂隙燈、二氧化碳孵箱(日本SANYO公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外抗腫瘤細胞增殖活性測試 Lewis腫瘤細胞接種在96孔板上，每孔接種1×104個細胞，在培養(yǎng)4～5 h后，細胞更換1%HS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，并且在同一培養(yǎng)基上用各自的待測樣品(VEGF、SMP)培養(yǎng)孵育，藥物濃度分別為0.45 μmol/L、0.9 μmol/L、1.8 μmol/L，對照組加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)終濃度為1 ng/ml，作用時間為24、48、72 h，通過比色試驗測定細胞數(shù)，求出IC50值。

1.2.2 體外抗腫瘤細胞遷移活性測試 Lewis腫瘤細胞接種在直徑35 mm Petri培養(yǎng)皿上，細胞生長聚集。在培養(yǎng)24 h后，使用細胞刮板作一個矩形缺損，細胞用無血清培養(yǎng)基沖洗3次，并且用各自的待測樣品(VEGF、SMP)培養(yǎng)孵育，藥物濃度分別為 0.45 μmol/L、0.9 μmol/L、1.8 μmol/L，對照組加入PBS，VEGF終濃度為1 ng/ml。在細胞遷移48 h后，在缺損邊緣任意選擇三個區(qū)域，使用10倍倒置顯微鏡計數(shù)細胞數(shù)。

1.2.3 兔角膜堿燒傷模型制備 將24只大白兔用濃度為3%戊巴比妥鈉進行兔耳外緣側(cè)靜脈注射(1 ml/kg)，將浸潤1 min的1 mol/L氫氧化鈉濾紙片(直徑0.3 mm)置于兔左眼角膜中央10 s后取下濾紙片，然后立即用20 ml生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜1 min。然后，隨機分為實驗(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)組.角膜燒傷12 h后、對照組滴生理鹽水，實驗組滴不同的濃度藥液20 μl，藥物濃度分別為 30 μmol/次、60 μmol/次 120 μmol/次，所有兔右眼均滴生理鹽水作陰性對照。3次/d，連續(xù)21 d后，用裂隙燈觀察并攝影，并計算角膜新生血管生長面積(A)，按公式A=C/12 ×3.1416〔r2-(r-L)2〕。

1.2.4 C57BL/6N純系小鼠腫瘤模型制備 選用6 w齡的C57BL/6N雄性小鼠40只，體重18～22 g，每鼠在左腹股溝皮下接種0.2 ml，細胞數(shù)為5×106后。隨機分為對照組、實驗(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)組，每組10只，接種瘤細胞后第二天開始在鼠腹股溝皮下注射給藥，藥物濃度分別為 30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L，每日一次，連續(xù)21 d，末次給藥后24 h處死動物，取瘤塊并稱重，計算抑瘤率=〔1－給藥組平均瘤重(T)/對照組平均瘤重(C)〕×100﹪。

1.3 統(tǒng)計方法方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體外抗腫瘤細胞增殖活性 在培養(yǎng)24 h后依濃度觀察，濃度在0.45～1.8 μmol/L，衰老標記蛋白(SMP)對Lewis細胞抑制能力開始上升，到培養(yǎng)48 h時達到最高抑制效果，與正常對照組比較其差異有統(tǒng)計學顯著意義(P＜0.05)，然后，在72 h開始下降，可見小分子雜合肽濃度與增殖抑制作用之間具有一定的時－效關(guān)系。見表1。

表1 小分子雜合肽對Lewis腫瘤細胞增殖的影響( ± s，n=5)

表1 小分子雜合肽對Lewis腫瘤細胞增殖的影響( ± s，n=5)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;下表同

0.556±0.364 0.482±0.013 0.465±0.035實驗組0.45 μmol/L 0.436±0.048 0.228±0.0131) 0.485±0.0750.9 μmol/L 0.444±0.040 0.201±0.0141) 0.462±0.0421.8 μmol/L 0.348 ±0.035 0.179 ±0.0161)24 h 48 h 72 h正常對照組組別0.392±0.066

2.2 體外抑制腫瘤細胞遷移活性 小分子雜合肽在不同藥物濃度下，能夠較明顯抑制Lewis腫瘤細胞遷移，并在濃度在(1.8 μmol/L)時，培養(yǎng)48 h抑制作用最為明顯，與正常對照組比較(P﹤0.01)，可見抑制細胞遷移數(shù)具有一定的劑量-依賴關(guān)系。見表2。

表2 小分子雜合肽對Lewis腫瘤細胞遷移的影響( ± s，n=3)

表2 小分子雜合肽對Lewis腫瘤細胞遷移的影響( ± s，n=3)

99.65±4.33實驗組0.45 μmol/L 76.26 ±1.861)0.9 μmol/L 58.13 ±2.121)1.8 μmol/L 24.67 ±1.221)組別 細胞遷移數(shù)正常對照組

2.3 雜合肽對堿燒傷后兔角膜新生血管生成作用的影響 雜合肽藥物在不同濃度劑量下，連續(xù)眼內(nèi)滴藥7 d，藥物濃度分別在60～120 μmol/L次時，都具有較明顯的抑制兔角膜新生血管作用，與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，并具有一定的量-效關(guān)系，但在第16天、第21天時，作用效果最為明顯，與正常對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。鏡下觀察，角膜水腫減輕，新生血管細小、稀疏，多集中于上、下角膜緣，呈緩慢性生長，其作用靶點可能為血管內(nèi)皮細胞。從而抑制兔角膜新生血管。見表3。

表3 不同時間小分子雜合肽對堿燒傷后兔角膜新生血管生成的影響(x ±s，n=6，mm2)

2.4 小分子雜合肽對C57BL/6N荷瘤鼠腫瘤抑制作用 在腫瘤小鼠瘤邊處連續(xù)注射給藥21 d，藥物濃度為60～120 μmol/L時，雜合肽抑瘤效果特別明顯，與正常對照組比較差異有顯著性意義(P＜0.01)，其抑制率為73.5%，其直接作用靶點可能為新生血管內(nèi)皮細胞，使實體瘤無法獲得足夠的營養(yǎng)，從而抑制腫瘤的生長。見表4。

表4 小分子雜合肽對C57BL/6N腫瘤小鼠的抑制作用( ± s，n=10)

表4 小分子雜合肽對C57BL/6N腫瘤小鼠的抑制作用( ± s，n=10)

組別 瘤重(g) 抑制率(%)1.60±0.45 0實驗組30 μmol/L 0.77 ±0.121) 51.860 μmol/L 0.57 ±0.451) 64.3120 μmol/L 0.43 ±0.281)正常對照組73.5

3 討論

在腫瘤治療中，盡管傳統(tǒng)的放、化療已取得了很大進展，但由于其在殺傷腫瘤細胞同時，也對人體產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，其中主要是骨髓抑制、免疫功能低下和腫瘤多藥耐藥。天然生物活性肽是一類存在動物、植物、微生物等生物體內(nèi)經(jīng)特殊提取分離工藝能直接得到的一類生物活性肽其中有一些在體內(nèi)或體外實驗中具有顯著抗腫瘤作用〔5〕。近年來，國內(nèi)外研究者試圖從天然物質(zhì)中獲取具有單一活性抗腫瘤多肽，已克服現(xiàn)有藥物不良反應(yīng)及腫瘤耐藥性。與傳統(tǒng)的化療和放療相比，天然抗腫瘤活性多肽最大優(yōu)點在于分子量小、活性高、不良反應(yīng)小、易于多途徑吸收、不易產(chǎn)生耐藥性。它們可針對腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)，特異性殺傷、抑制腫瘤細胞，顯示出極好的應(yīng)用前景?；谀壳把苌呻难芯窟M展，本研究設(shè)計并合成的小分子雜合肽通過建立Lewis肺癌皮下移植瘤及堿燒傷后兔角膜新生血管模型來探討小分子肽對新生血管的抑制作用。研究顯示，在瘤體邊緣每天注射小分子雜合肽及兔角膜眼內(nèi)滴藥濃度在120 μmol/L，并連續(xù)給藥21 d，能明顯抑制堿燒傷后兔角膜及腫瘤新生血管生成，使瘤體明顯縮小，抑制率為73.5%，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)，抑瘤效應(yīng)隨著藥物劑量的增加抑制率逐漸增大，結(jié)果證實了新的雜合肽抑制腫瘤血管退化同時，可以引起瘤體的消退，使腫瘤體積明顯縮小，體重外周血白細胞數(shù)量及未見明顯變化，無異常反應(yīng)及死亡。結(jié)果提示，新的雜合肽是一種安全、有效、無毒副作用的血管生成抑制劑。

有研究表明，大部分治療腫瘤藥物的作用靶點為腫瘤細胞，一個突出的問題既產(chǎn)生耐藥性。而內(nèi)皮細胞具有一套正常的、完整的染色體，具有穩(wěn)定的遺傳性，因而通過血管生成抑制因子治療腫瘤不易產(chǎn)生耐藥性〔6〕。內(nèi)皮細胞是血管形成的首要步驟，抑制內(nèi)皮細胞增殖，也就有效的抑制血管的形成。針對血管內(nèi)皮細胞這一特點，本文通過體外實驗進一步研究新的雜合肽對血管內(nèi)皮細胞增殖及遷移活性的影響，結(jié)果表明，新的雜合肽能明顯抑制Lewis腫瘤細胞的增殖及遷移，當濃度為1.8 μmol/L并作用48 h時，腫瘤細胞增殖、遷移明顯被抑制，與正常對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，此結(jié)果證實了新的雜合肽可能直接作用與運動的及增殖的血管內(nèi)皮細胞，在48 h作用最明顯。體外實驗結(jié)果對此已證實。并且，在細胞水平和整體水平上，實驗結(jié)果上具有一定相關(guān)性，其作用機制可能直接作用靶點為新生血管內(nèi)皮細胞。使實體瘤無法獲得足夠的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，來抑制腫瘤血管生成，使腫瘤處于無血管期，從而抑制腫瘤的生長。本文中新的雜合肽有望成為一種高效、低毒，易得的抗腫瘤血管生成抑制劑。

1 陳貫虹，遲建國，邱維忠，等.多肽藥物研究進展〔J〕.山東科學，2008;21(3):42-8.

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4 徐桂華，畢力夫，蘇秀蘭.抗腫瘤生物活性肽研究進展〔J〕.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2007;2(2):130-2.

5 王曉蘭，王建剛.天然抗腫瘤活性多肽作用機制研究現(xiàn)狀〔J〕.醫(yī)學綜述，2009;15(8):1180-4.

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