錢 江 陳旺盛 文坤明 傅仲學(xué) 王素梅 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，重慶 40006)

Slug作為Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，有高度保守的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，通過連接到E－box以抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E－cadherin)是上皮組織中類依賴Ca2+的細(xì)胞間粘連跨膜糖蛋白分子，可以在胞漿內(nèi)形成E－鈣黏蛋白－β－連環(huán)蛋白－α－連環(huán)蛋白復(fù)合體，此復(fù)合體再直接連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架上，用以維持細(xì)胞間黏附的穩(wěn)定性和細(xì)胞的極性。Slug是E－cadherin啟動子的抑制子，參與控制細(xì)胞分化和凋亡的不同進(jìn)程。本研究探討Slug和E－cadherin的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展作用以及Slug和E－cadherin之間有無相關(guān)性，為診斷、治療、預(yù)防結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2003年1月至2004年3月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院接受手術(shù)治療的結(jié)、直腸癌患者65(男37，女28)例，年齡24～83(中位62)歲，全部病例均經(jīng)病理證實(shí)。其中結(jié)腸癌39例，直腸癌26例;高中分化腺癌36例，低分化腺癌29例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例。Dukes分期:A+B期31例，C+D期34例。另取癌旁組織(距癌組織5 cm以上)25例作為對照組。所有病例術(shù)前均未行放化療及免疫治療。所有標(biāo)本均經(jīng)過甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。65例患者無住院期間死亡，隨訪日期從患者術(shù)后第1日開始計算，隨訪至2010年1月，隨訪時間6～60個月、失訪3例。試劑:鼠抗人Slug單克隆抗體(SC－166476)購自美國 Santa Cruz公司，鼠抗人 E－cadherin單克隆抗體(SC－7963)購自美國Santa Cruz公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 石蠟切片脫蠟至水;滴加一抗的組織切片用EDTA緩沖液高壓熱修復(fù)10 min，修復(fù)后的切片在緩沖液中冷卻后，滴加過氧化物酶阻斷溶液;用50～100 ml正常山羊血清封閉，滴加一抗，工作濃度為1∶100，4℃冰箱孵育過夜;滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液;DAB顯色;以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評分，染色陽性信號以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色為準(zhǔn)，呈棕黃色顆粒，細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯高于背景呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。按切片中陽性細(xì)胞比例分別記0～4分:在5個高倍視野下，切片中陽性細(xì)胞≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51%～75%記3分，＞75%為4分;按染色深淺分別為0～3分，染色深度以多數(shù)細(xì)胞為準(zhǔn)，無陽性細(xì)胞為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;免疫反應(yīng)的得分為陽性細(xì)胞的百分率得分與免疫染色的強(qiáng)度得分的乘積，再按這兩項(xiàng)指標(biāo)的總積分將結(jié)果分成4級:0分為(－)，1～2分為(+)，3～4分為()，5～12 分為()。其中(－)和(+)為低表達(dá)，()和()為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，Kaplan－Meier法計算生存率，Log－rank檢驗(yàn)，單因素Cox回歸分析，Cox比例風(fēng)險模型多因素分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Slug和E－cadherin蛋白在不同組織中的表達(dá) Slug位于結(jié)直腸癌組織的細(xì)胞質(zhì)中，陽性率為47.1%，在正常大腸黏膜組織中幾乎無表達(dá)，正常大腸黏膜E－cadherin定位于上皮細(xì)胞膜，大腸癌組織中 E－cadherin胞膜表達(dá)不同程度缺失，為55.4%。見圖1。

圖1 Slug和E-cadherin在結(jié)腸的表達(dá)(DAB，×200)

2.2 Slug和E－cadherin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 Slug蛋白異常表達(dá)與腫瘤部位、腫瘤大小相關(guān)性不顯著，而與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。E－cadherin蛋白陽性表達(dá)與腫瘤部位、腫瘤大小相關(guān)性不顯著，而與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表1。

2.3 結(jié)直腸癌中Slug和E－cadherin蛋白表達(dá)相關(guān)性 經(jīng)統(tǒng)計分析在結(jié)直腸癌中Slug陽性表達(dá)32例，其中E－cadherin表達(dá)缺失13例;Slug陰性表達(dá)33例，其中E－cadherin表達(dá)缺失23例，二者表達(dá)無相關(guān)性(P=0.644)。

2.4 生存分析 Slug陽性表達(dá)患者生存時間明顯短于Slug陰性表達(dá)患者(P＜0.05);E－cadherin膜表達(dá)缺陷患者生存時間明顯短于有E－cadherin表達(dá)缺陷患者(P＜0.05)，見圖2。

2.5 Cox比例風(fēng)險模型多因素分析 先用單因素Cox模型對腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、浸潤深度、腫瘤大小進(jìn)行初步篩選，然后用Cox多因素分析，統(tǒng)計分析表明 Slug、E－cadherin、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期可成為影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素(P＜0.05);其中Slug相對危險度為2.832(P=0.000)，E－cadherin相對危險度為2.741(P=0.007)，見表2。

圖2 Slug和E-cadherin表達(dá)患者生存曲線

表1 Slug和E-cadherin的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系〔n(%)〕

表2 結(jié)直腸癌患者預(yù)后多因素分析

Slug高表達(dá)參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，與文獻(xiàn)報道基本一致〔1〕。但與Martin等〔2〕研究乳腺癌Slug表達(dá)與TNM分期無明顯相關(guān)不一致，可能所涉及信號通路不同有關(guān)。Slug高表達(dá)也預(yù)示著結(jié)直腸癌患者有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，提示病人的預(yù)后不佳，其測定同樣有助于早期判斷預(yù)后。本研究提示Slug的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。

E－鈣黏蛋白(E－cadherin)是一種單跨膜糖蛋白，能在細(xì)胞與細(xì)胞黏附中以同種分子間，拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合形式介導(dǎo)細(xì)胞黏附，研究證實(shí)在絕大多數(shù)惡性腫瘤中如乳腺癌、腸癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮膚癌、腎癌和肺癌都存在有上皮－間葉變(EMT)造成E－cadherin表達(dá)下調(diào)，并導(dǎo)致介導(dǎo)的細(xì)胞－細(xì)胞間黏附功能削弱或喪失〔3〕，并致腫瘤細(xì)胞極易脫離原發(fā)灶且易于向周圍組織侵襲，為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了必要的條件。本研究提示E－cadherin異常表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。邱雪彬等〔4〕研究認(rèn)為E－cadherin表達(dá)與某些腫瘤的分化程度有關(guān)，而本研究提示 E－cadherin可能參與調(diào)控結(jié)腸癌的分化。Nabeshima等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力與 E－cadherin表達(dá)有關(guān)，而在人體實(shí)體瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌〔4〕、舌癌〔6〕中E－cadherin異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文顯示E－cadherin膜表達(dá)缺失與結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明E－cadherin具有抑制腫瘤侵襲的功能，且是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。這可能與結(jié)腸癌E－cadherin膜表達(dá)缺失病例較易發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移而影響預(yù)后有關(guān)。本研究還表明，Ecadherin和Slug的表達(dá)均與病人腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)Ecadherin和Slug蛋白表達(dá)相關(guān)性分析顯示，Ecadherin和Slug表達(dá)無相關(guān)性，這與Shioiri等〔7〕研究結(jié)果一致，這種相關(guān)性的缺乏可能是由于在結(jié)直腸癌中E－cadherin下調(diào)常常是通過啟動子的超甲基化的作用而不是通過基因結(jié)構(gòu)的改變引起〔8〕。

1 Zhang KJ，Zhang BY，Zhang KP，et al.Clinicopathologic significance of slug expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma〔 J〕.World J Gastroenterol，2010;16(20):2554－7.

2 Martin TA，Goyal A，Watkins G，et al.Expression of the transcription factors snail，slug，and twist and their clinical significance in human breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2005;12(6):488－96.

3 黃 菊，程夏楷，楊 彬，等.E－鈣黏蛋白復(fù)合體及其對腫瘤細(xì)胞的作用〔J〕. 生命的化學(xué)，2005;25(3):247－50.

4 邱雪彬，楊 秀，李慶昌，等.上皮性鈣黏附蛋白和β－連環(huán)素的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中華病理學(xué)雜志，2002;31(4):318－21.

5 Nabeshima K，Inoue T，Shimao Y，et al.Cohort migration of carcinoma cell:differetiated colorectal carcinoma cells move as coherent cell clusters or sheets〔J〕.Histol Histopathol，1999;14(6):1183－97.

6 鄭天榮，李建成，劉秀英.E－鈣黏附素和CD44v6在舌癌中的表達(dá)及其意義〔J〕. 診斷病理學(xué)雜志，2002;9(2):98－9.

7 Shioiri M，Shida T，Koda K，et al.Slug expression is an independent prognostic parameter for poor survival in colorectal carcinoma patients〔J〕.Br J Cancer，2006;94:1816－22.

8 Garinis GA，Menounos PG，Spanakis NE，et al.Hypermethylation－associated transcriptional silencing of E－cadherin in primary sporadic colorectal carcinomas〔J〕.Pathol，2002;198:442－9.