盧美貞，崔海瑞

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 310014;2.浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310029)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在芽孢形成時(shí)可產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白［1］，被稱為殺蟲晶體蛋白或 δ-內(nèi)毒素［2］。Schnepf等［3］首次成功地克隆了第1個(gè)編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的序幕。目前它已成為植物抗蟲基因工程中應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因。

浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所首次成功地將來自Bt密碼子優(yōu)化的以玉米泛素為啟動(dòng)子的Cry1Ab抗蟲基因轉(zhuǎn)入高粱中［4］，并經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)進(jìn)入中間試驗(yàn)階段。轉(zhuǎn)基因高粱的獲得為這一作物的品種改良提供了抗蟲資源。為有效和合理地利用這一資源，有必要了解不同光照時(shí)間、不同溫度和不同水平氮肥處理下，Cry1Ab基因在高粱中的表達(dá)情況。本研究以轉(zhuǎn)Cry1Ab基因高粱SR16-2和SR24-2為材料，研究不同光照時(shí)間、不同溫度和不同水平氮肥處理下，Cry1Ab基因在高粱中的表達(dá)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用的材料為高粱原受體親本115R及其轉(zhuǎn)入Cry1Ab基因的2個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系，這2個(gè)株系處于 R5代，編號(hào)分別為 SR16-2和 SR24-2，它們分別來自2個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株，系采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育而成［4］。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 光照處理

取SR16-2和SR24-2株系干種子各100粒，進(jìn)行常規(guī)浸種、催芽，種子萌動(dòng)后放在人工培養(yǎng)室28℃恒溫下培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)20粒種子，設(shè)置的光照時(shí)間分別為 10，12，14，16和18 h，待幼苗長(zhǎng)到3葉期時(shí)，各處理隨機(jī)取幼苗(去根)5個(gè)測(cè)Cry1Ab蛋白含量。

1.2.2 溫度處理

取SR16-2和SR24-2株系干種子各100粒，進(jìn)行常規(guī)浸種、催芽，種子萌動(dòng)后放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日相同光強(qiáng)光照12 h，設(shè)計(jì)了5個(gè)溫度水平，分別為20，25，30，35和40℃，濕度在75%左右，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)20粒種子，待幼苗長(zhǎng)到3葉期時(shí)，各處理隨機(jī)取幼苗(去根)5個(gè)，測(cè)Cry1Ab蛋白含量。

1.2.3 施氮水平處理

取SR16-2和SR24-2株系干種子各100粒，進(jìn)行常規(guī)浸種、催芽，萌動(dòng)后將種子播種于網(wǎng)室，分別設(shè)置 4個(gè)基肥純氮水平，0，300，450和600 kg·hm－2，進(jìn)行常規(guī)栽培，在拔節(jié)期各處理分別隨機(jī)選5株取葉片測(cè)Cry1Ab蛋白含量。

1.3 Cry1Ab蛋白測(cè)定

以上所取樣品洗凈后稱重，在液氮中磨成粉狀，放入離心管中，按4 μL·mg－1的比例加適量蛋白提取緩沖液(試劑盒隨帶)，充分混勻后置于4℃浸提3 h，5 000 r·min－1離心 5 min，上清液或其稀釋液即可用于測(cè)定。將100 μL樣品提取液加入到已包埋好抗體的96孔板中，同時(shí)加入不同濃度(0，0.5，2.5，5.0 ng·mL－1)的 Cry1Ab蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 Cry1Ab/Cry1Ac板式試劑盒(美國(guó)ENVIROLOGIX公司)提供的方法進(jìn)行測(cè)定，最后根據(jù)酶標(biāo)儀(SpactronMax190，德國(guó))在波長(zhǎng)為450 nm下D的讀數(shù)，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線和提取液稀釋倍數(shù)計(jì)算出各器官組織Cry1Ab殺蟲蛋白含量，以樣品中所含的Cry1Ab蛋白含量來表示(ng·g－1)，測(cè)定時(shí)各設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照時(shí)間對(duì)Cry1Ab蛋白量的影響

對(duì)不同光照長(zhǎng)度處理的Cry1Ab蛋白含量測(cè)定結(jié)果如圖1。

圖1 不同光照時(shí)間下轉(zhuǎn)基因高粱幼苗中Cry1Ab蛋白含量

由圖1可見，在10，12，14，16和18 h等不同光照時(shí)間處理后，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的Cry1Ab蛋白含量平均分別為 1.05，2.10，1.40，1.94和1.67 ng·g－1，以光照12 h時(shí)的 Cry1Ab蛋白含量最高，光照10 h的表達(dá)量最低，二者相差1倍以上，表現(xiàn)趨勢(shì)為12 h＞16 h＞18 h＞14 h＞10 h，且2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。說明光照長(zhǎng)度對(duì)Cry1Ab蛋白表達(dá)量具有一定的影響。

2.2 不同溫度處理對(duì)Cry1Ab蛋白量的影響

對(duì)Cry1Ab蛋白含量測(cè)定結(jié)果顯示，不同溫度處理對(duì) Cry1Ab蛋白含量也有較大影響(圖2)。25℃培養(yǎng)時(shí)葉片中 Cry1Ab蛋白含量最高，達(dá)到2.24 ng·g－1，溫度升高，Cry1Ab蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，40℃最低，只有0.44 ng·g－1，20℃時(shí)葉片中Cry1Ab蛋白含量比35℃略高?？梢姕囟纫彩怯绊慍ry1Ab蛋白表達(dá)水平的一個(gè)重要環(huán)境因素。

圖2 不同溫度處理下轉(zhuǎn)基因高粱幼苗中Cry1Ab蛋白含量

2.3 不同施肥水平對(duì)Cry1Ab蛋白量的影響

圖3是對(duì)不同施氮水平下Cry1Ab蛋白量的測(cè)定結(jié)果。當(dāng)以 300，450，600 kg·hm－2不同施氮水平作基肥處理時(shí)，SR16-2轉(zhuǎn)基因高粱株系葉片中的Cry1Ab蛋白含量比未施基肥的對(duì)照分別顯著提高85.40%、48.66%和12.90%;在另一轉(zhuǎn)基因高粱株系SR24-2中，施肥后的Cry1Ab蛋白含量與對(duì)照相比差異更大，分別提高了200.42%，50.42%和39.58%。結(jié)果表明，施肥可以促進(jìn)Cry1Ab蛋白的合成，作基肥的以300 kg·hm－2純氮效果最佳。

圖3 不同施N基肥量下轉(zhuǎn)基因高粱Cry1Ab蛋白含量

3 小結(jié)與討論

Bt蛋白含量的高低直接影響著轉(zhuǎn) Bt基因植物的抗蟲效果，而環(huán)境因素對(duì)Bt基因的表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用［5］，尤其是當(dāng) Bt基因處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下時(shí)，這種影響更為突出。因此，闡明環(huán)境因素對(duì)Bt基因表達(dá)水平的影響對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因植物的合理栽培與利用具有重要的指導(dǎo)作用。本研究的結(jié)果表明，光照、溫度和氮肥對(duì)Cry1Ab蛋白表達(dá)量都具有明顯的影響，為轉(zhuǎn)Cry1Ab基因高粱的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

溫度對(duì)外源基因的表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用［6］。Takimot等［7］曾報(bào)道玉米泛素啟動(dòng)子的表達(dá)不受系統(tǒng)調(diào)節(jié)，而是受獨(dú)立的對(duì)熱擊或物理脅迫產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞調(diào)節(jié)，在受脅迫情況下，該啟動(dòng)子會(huì)改變它的表達(dá)特性。此外，Meyer［8］也曾報(bào)道過溫度會(huì)影響轉(zhuǎn)基因矮牽牛中35S啟動(dòng)子的甲基化。本研究所用轉(zhuǎn)基因高粱中的Cry1Ab基因是由玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，研究結(jié)果顯示，溫度對(duì)轉(zhuǎn)基因高粱Cry1Ab蛋白含量有較大的影響，高溫不利于Cry1Ab蛋白的表達(dá)，這與吳剛［9］對(duì)玉米泛素啟動(dòng)子控制的Cryab在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)量受溫度調(diào)節(jié)的研究結(jié)果相一致，都證明了 Takimoto等［7］的結(jié)論，也與夏蘭芹等［10］報(bào)道棉花中35S啟動(dòng)子引導(dǎo)的Bt基因所表達(dá)的殺蟲蛋白量在高溫脅迫后急劇下降的結(jié)果相似。此外，在轉(zhuǎn)Bt基因棉花中也有因氣溫反常導(dǎo)致抗蟲性下降的報(bào)道［11］。因此，在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植物的種植過程中，應(yīng)根據(jù)溫度預(yù)報(bào)情況加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，在高溫期到來之際綜合采用其他防治措施。

合理施肥是作物栽培管理的關(guān)鍵。施肥直接促進(jìn)根系對(duì)氮素等養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而影響植株體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。在轉(zhuǎn)Bt基因棉花中，王家寶等［12］報(bào)道追肥可提高葉片中的Bt蛋白含量，且隨追肥量的增加而增加;周冬生等［13］也報(bào)道隨追肥量的增加轉(zhuǎn)Bt基因棉抗蟲性增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，施氮基肥有助于Cry1Ab蛋白含量的提高，但是隨著施氮量的增加Cry1Ab蛋白含量并未呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，反而有所下降。由此可見，作基肥與追肥的效果不同。因此，對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植物的施肥，不但要控制氮肥的量，還應(yīng)講究施肥方式。

光照直接影響著植物的生長(zhǎng)、發(fā)育。有關(guān)光照對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響，在轉(zhuǎn)玉米A1基因的矮牽牛中已有報(bào)道［7］，但光照是否影響 Bt基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平尚未見報(bào)道。高粱屬短日照植物，臨界光周期約為12 h。本研究中發(fā)現(xiàn)光照12 h時(shí)轉(zhuǎn)基因高粱葉片中的Cry1Ab蛋白量最高，光照長(zhǎng)于或短于這一時(shí)間均導(dǎo)致Cry1Ab蛋白含量的降低。因此，要獲得較好的抗蟲效果，在種植轉(zhuǎn)Bt基因高粱時(shí)應(yīng)從光照長(zhǎng)度這一角度考慮其合適的地域。

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