吉慶勇，華金渭，程文亮，朱 波，王喜周，李美美

(1.浙江省麗水市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江麗水 323000;2.麗水學院醫(yī)學院，浙江 麗水 323000;3.浙江省醫(yī)學科學院，浙江 杭州 323000)

三葉青(Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg)為葡萄科植物三葉崖爬藤地下塊莖，屬于我國特有植物，分布在浙江、江西、云南等省份。其性涼，味辛、無毒，常用于治療高熱驚厥，小兒感冒發(fā)燒、肝炎、支氣管炎及支氣管哮喘等癥，對一些病毒性疾病，慢性和遷延性疾病有很好的功效［1－2］。三葉青中的化學成份主要有黃酮、黃酮苷、淀粉、還原糖、甾類化合物、氨基酸等［3］，其中黃酮是重要的生理活性物質(zhì)，具有很好的抗腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡等作用［4－5］。

隨著對三葉青藥用價值的深入研究，市場需求量必然進一步增加，而野生資源由于過度采挖，已瀕臨滅絕狀態(tài)。因此，既要保護數(shù)量極少的野生三葉青資源，又要滿足市場需要，促進其可持續(xù)發(fā)展，開展三葉青的人工種植十分必要。麗水市農(nóng)科院近年來開展三葉青引種栽培和野生馴化，已人工種植20余畝。本文采用紫外可見分光光度法測定麗水地區(qū)不同區(qū)域野生和人工種植三葉青中的黃酮含量，并對結(jié)果進行了分析［6］，以期為今后大面積的三葉青人工種植提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-120-02型紫外-可見分光光度計(日本島津);BP-II-5分析天平(上海醫(yī)用激光儀器廠生產(chǎn))，SHZ-C型水循環(huán)式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);202A-2電熱干燥箱(上海陽光試驗儀器有限公司)等。蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號 100080-200306)，乙醇、NaNO2，Al(NO3)3，KOH均為分析純。

1.2 試驗材料

于2011年3月至4月，從麗水松陽縣、麗水蓮都區(qū)、麗水景寧縣、麗水青田縣、麗水農(nóng)科院栽培基地實地采集三葉青樣品，全部為鮮品(編號為:S1-人工、S2-人工、S3-人工，均為農(nóng)科院三葉青種植基地5年生樣品，野生樣品編號為S4-松陽、S5-景寧、S6-蓮都、S7-青田)。

1.3 方法

1.3.1 測定波長的選擇

取對照品和供試品分別置25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以紫外可見分光光度法測定在200～700 nm區(qū)間掃描吸收曲線。供試品溶液在500 nm處有最大吸收，與蘆丁對照溶液吸收曲線相似，故選用500 nm為測定波長［7］。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品2.80 mg置于50 mL，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，得濃度為0.056 mg·mL－1的蘆丁對照品溶液。

1.3.3 標準曲線的繪制

精密吸取 0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 mL蘆丁對照溶液，分布置于10 mL容量瓶中，方法同1.3.1，測定吸光值，得標準曲線為 C=9.137×10－2A －4.524 ×10－3，其線性范圍為 8.02 ～39.35 mg，r2=0.998 9。

1.3.4 供試品溶液的制備與含量測定

取本品粉碎，過60目(0.25 mm)篩，精密稱取0.50 g，置圓底燒瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流提取2次，每次1 h，取出冷卻，過濾，濾液揮發(fā)干，殘渣用適量乙醇溶液轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。精密量取0.5 mL，分別置10 mL量瓶中，按1.3.1中方法測定吸光度，試驗重復3次。

1.3.5 重現(xiàn)性試驗

精確稱取三葉青樣品3.0 g，處理后在500 nm處測定吸光度，重復5次，回歸方程法計算平均總黃酮的質(zhì)量濃度，其RSD為1.67%。該試驗方法重現(xiàn)性較好。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取0.4 mL供試品溶液于10 mL刻度試管中，加5%亞硝酸鹽溶液1.0 mL，搖勻放置5～6 min;加1.5 mol·L－1氫氧化鈉溶液 5.0 mL，加70%乙醇至滿刻度，搖勻放置10 min;取2.0～3.0 mL顯色液于比色皿中在500 nm之間掃描測定吸光度，每隔0.5 h測定1次，共測定7次，樣品提取液3 h穩(wěn)定性較好。

1.3.7 精密度試驗

精密稱取蘆丁標準溶液1 mL，同“標準曲線的繪制”操作，連續(xù)測量6次，測定吸光度值，RSD為2.12%。

1.3.8 加樣回收率試驗

精密吸取蘆丁對照溶液1.0，1.5，2.0 mL各3份，分別加入供試品溶液3 mL，處理后在500 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量，得其平均回收率為99.76%，RSD為2.61%。

2 結(jié)果與分析

人工種植與野生三葉青總黃酮的含量比較見表1。人工種植三葉青總黃酮含量最高為S2基地，含量達 11.226 8 mg·g－1，平均為 10.194 3 mg·g－1。野生樣品平均總黃酮含量為10.160 1 mg·g－1，其中麗水松陽樣品含量最高，達到10.925 9 mg·g－1，麗水蓮都最低，僅為 9.162 5 mg·g－1。研究結(jié)果表明，人工種植三葉青總黃酮含量與野生三葉青無顯著差異(P＞0.05)。從黃酮含量看，人工種植三葉青可以替代野生三葉青，彌補三葉青野生資源的不足，為開發(fā)三葉青中藥產(chǎn)品提供優(yōu)質(zhì)原料。

表1 人工種植與野生三葉青中總黃酮的含量(n=3)

3 小結(jié)和討論

三葉青作為一種珍稀的中藥，化學成分復雜，其開發(fā)利用尚處起步階段，其中所含主要化學成分黃酮具有顯著的生物學活性，具有很好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤的特點。對野生與人工種植產(chǎn)品總黃酮含量的分析、比較，科學評價人工種植三葉青的質(zhì)量，對控制三葉青藥材質(zhì)量，深入開展三葉青的種植馴化研究及資源利用有重要意義，為開發(fā)利用三葉青資源和確保人工種植的品質(zhì)提供了科學的依據(jù)。

［1］楊學樓，羅經(jīng)，孫松柏，等．三葉青抗病毒作用的研究［J］．湖北中醫(yī)雜志，1989(4):40.

［2］鐘曉明，毛慶秋，黃真，等．三葉青提取物對燙傷大鼠腸道局部和全身免疫功能的影響［J］．中藥材，2006，29(9):953.

［3］李瑛琦，陸文超，于治國，等．三葉青的化學成分研究［J］．中草藥，2003(11):34.

［4］丁剛強，鄭軍獻，魏克民，等．三葉青提取物對肝癌細胞HepG-2及原代大鼠肝細胞的體外毒性作用研究［J］．浙江預防醫(yī)學，2005，17(9):122.

［5］馮正權(quán)，倪克鋒，何煜，等．三葉青黃酮誘導 SGC-7901胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］．中國臨床藥理學與治療學，2006，11(6):669.

［6］毛一亮，張佳佳，丁萍月，等．正交設(shè)計法優(yōu)化三葉青中總黃酮的提取工藝［J］．西北藥學雜志，2008，12(28):369.

［7］蔣新龍．廣玉蘭葉、花總黃酮提取方法與含量比較［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學，2010(3):648－650，664.