千 珂 王 榮 張偉東 唐志書 顧 宜 王曉娟

1.陜西中醫(yī)學院藥學院，陜西 咸陽 712046；2.第四軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032

元仁膠囊由元胡、酸棗仁等中藥組成，具有寧心安神、益肝養(yǎng)血的功效，用于心肝血虛引起的焦慮、失眠、抑郁癥狀。元胡主要的活性成分為延胡索乙素及其他生物堿，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠及安定作用。國內外研究表明，延胡索乙素在高架十字迷宮模型上具有抗焦慮的作用，可能與GABA受體的苯二氮結合位點有關。延胡索乙素能夠通過抑制杏仁體釋放多巴胺來抑制南印防己毒素誘導的大鼠自主運動（包括水平運動、垂直運動以及運動距離）和旋轉次數增加，也能減少大鼠在冰水中的自主運動頻率。提高抗應激能力。延胡索總堿除了有一定的鎮(zhèn)靜作用，還能提高小鼠的抗疲勞能力及耐缺氧能力，從而提高了機體的抗應激能力[1-2]。對應激狀態(tài)下心肌缺血壞死具有保護作用。制劑中的另一組分酸棗仁提取物或含其復方藥物具有抗抑郁抗焦慮、改善應激的作用，影響焦慮大鼠行為學、血漿神經肽Y和單胺類神經遞質[3-4]。酸棗仁提取物組分復雜，各組分含量較低，因此對酸棗仁有效組分/指標成分的選擇及測定都較為困難。延胡索乙素在制劑中含量高，因此采用高效液相色譜法對樣品中延胡索乙素進行了質量控制研究，經考察方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC2010A HT高效液相色譜儀（日本島津）；BT125D十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯）；DL-180超聲儀（浙江省向山縣石蒲海天電子儀器廠）；Diamonsil C18分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；甲醇為色譜純；純凈水；其他試劑均為分析純。

酸棗仁皂苷A對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：110734-200510），延胡索乙素對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：110726-200610）；元仁膠囊（院內自制）。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別酸棗仁皂苷A

取本品內容物1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL溶解，作為供試品溶液。另取酸棗仁皂苷A對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點與同一硅膠-G薄層板上，以水飽和的正丁醇為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，立即檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，應顯相同顏色的斑點。薄層圖譜清晰，并且陰性無干擾。

2.2 含量測定

元胡主要含有效成分延胡索乙素，參照文獻含量測定方法[5]，采用高效液相色譜法測定本品中延胡索乙素的含量。

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18分析柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調 pH 值至 6.0）（55∶45）；柱溫：室溫；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；理論板數按延胡索乙素峰計算應不低于2000。見圖1。陰性對照溶液在與延胡索乙素對照品色譜圖相同位置無干擾峰，表明樣品中其他成分對延胡索乙素的測定無干擾。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，加50 mL甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取樣品，約相當于延胡索乙素5 mg，精密稱重，置50 mL量瓶中，加80%甲醇20 mL，超聲30 min，并用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，測定，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取處方量的除延胡索提取物以外的各組分，按元仁膠囊制備工藝制成陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.5 線性關系考察 精密稱取減壓干燥至恒重的延胡索乙素對照品5.02 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表1。

以峰面積平均值（Y）對進樣量（X）進行回歸的標準曲線方程：Y=904386X+2997.2，r=0.9999。以峰面積對進樣量作圖，得標準曲線圖。結果表明延胡索乙素在0.2～2.0 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度考察 取“2.2.2”項下同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次依測定法進行測定，記錄延胡索乙素色譜峰面積，結果RSD為0.54%。

2.2.7 重復性實驗 取樣品（批號：20080614）5份，分別精密稱取（約相當于延胡索乙素5 mg），照本品含量測定方法進行測定。見表2。結果表明，本方法重復性良好。

表1 延胡索乙素線性考察結果

表2 重復性考察結果

2.2.8 方法穩(wěn)定性考察 取同一對照品溶液，分別于0、2、4、8、12 h參照本品含量測定方法進樣，測定延胡索乙素的峰面積，平均峰面積為902792，RSD為0.99%（n=5）。結果表明，本品溶液中延胡索乙素在12 h內穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結果

2.2.9 回收率試驗 分別精密稱取已知含量的樣品 （批號：20080614）適量（約相當于延胡索乙素2 mg）9份，分別精密加入減壓干燥至恒重的延胡索乙素對照品適量，使其含量分別為4、6、8 mg。照本品含量測定方法進行測定，并計算回收率，結果顯示本方法準確度良好。見表4。

2.2.10 樣品含量的測定 取樣品3批，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，以“2.2.1”項下色譜條件測定，每批樣品測定3次取平均值，按外標法計算每粒中延胡索乙素的含量。見表5。本品每粒含延胡索乙素（C21H25NO4）不少于25.0 mg。

3 討論

3.1 TLC展開劑

本實驗中酸棗仁鑒別中所采用的TLC展開劑分別參見《中國藥典》2010年版酸棗仁及棗仁安神膠囊鑒別項下的相關條件[5]。

表4 回收率實驗結果

表5 三批樣品的含量測定結果（n=3）

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)選

文獻收載的測定中成藥（丸劑、片劑或顆粒劑）中延胡索乙素時，采用的溶劑有含氨甲醇、6%醋酸和乙醚等[6-7]；提取方法常采用回流或超聲的方法。筆者在本研究中考察了不同溶劑、不同提取方法以及不同提取時間對延胡索乙素的提取情況，發(fā)現(xiàn)膠囊輔料和成藥中其他成分對延胡索乙素的提取有較大的影響。

3.2.1 提取溶劑的優(yōu)選 筆者考察了甲醇、80%甲醇和50%甲醇3種溶劑，經超聲相同時間后，測定延胡索乙素峰面積，依次為1087342、1076452和875932，表明以甲醇或80%甲醇作為提取溶劑均較好，但甲醇提取溶劑較80%甲醇提取溶劑色譜圖中雜質峰峰面積更大，因此選擇80%甲醇為提取溶劑。

3.2.2 提取方法的優(yōu)選 筆者曾以80%甲醇為溶劑，考察采用直接超聲提取法和水浴回流提取法對延胡索乙素的提取的影響。實驗結果表明：加入80%甲醇后不論是加熱還是超聲都可以提取完全，峰面積基本相同。但超聲操作起來簡便，快速，因此選擇超聲提取。實驗考察了超聲20、30、40、50 min的提取效果，結果表明延胡索乙素在30 min內基本提取完全。

3.3 流動相的優(yōu)選

有文獻報道測定延胡索乙素使用流動相甲醇-水（70∶30）或甲醇-乙腈-0.1%氨水（磷酸調pH至9.0）[7-8]，前者峰形不對稱，后者pH較高，影響柱壽命。因此參照《中國藥典》2010年版一部“延胡索”項下所用流動相為“甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調 pH 值至 6.0）（55∶45）”，并對水相和有機相的比例進行適當調整，考察其對樣品分離度的影響，結果在有機相從40%增加至70%，延胡索乙素可與相鄰峰分開。0.1%磷酸加入0.2%三乙胺調節(jié)pH值至6.0，pH值適中，三乙胺對延胡索乙素峰形有明顯改善作用。最終確定流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調 pH 值至 6.0）（55∶45）。

3.4 檢測波長的選擇

用二極管陣列紫外檢測器，在200～400 nm對延胡索乙素對照品峰進行紫外掃描，測得延胡索乙素的最大紫外吸收波長為230、280 nm，230 nm檢測靈敏度較高，但干擾較大，參考《中國藥典》2010年版一部，確定測定波長為280 nm。筆者在本實驗中根據元仁膠囊的特點，對供試品溶液的制備方法進行了改進，方法簡便易行，對其他中成藥的樣品處理有一定的借鑒作用。

[1]王紅，田明，王淼，等.延胡索現(xiàn)代藥理及臨床研究進展[J].中醫(yī)藥學報，2010，38（6）：108-111.

[2]魯春梅，張春森，姜立勇.延胡索化學成分及藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2011，5（15）：126-127.

[3]王守勇，謝鳴，王欣.酸棗仁湯組分配方對高架十字迷宮大鼠神經肽Y 及細胞因子的影響[J].中成藥，2011，33（1）：142-145.

[4]彭善祥.酸棗仁的化學成分及其藥理活性的研究結果[J].中國醫(yī)藥指南，2009，7（4）：47-48.

[5]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：343，801.

[6]鄭琴，郝偉偉，楊明，等.RP-HPLC同時測定止痛方提取物中6個成分的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（7）：1269-1272

[7]田金苗，李曉欣，張滿來.HPLC法測定氣滯胃痛膠囊中延胡索乙素的含量[J].中國藥事，2011，25（5）：481-485.

[8]余繼英，陳璐，鄒靜，等.復方棗仁片中左旋延胡索乙素的生物等效性[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31（8）：663-666.