汪程遠 張 燕 譚月晗

重慶工商大學(xué)藥物化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)研究中心，重慶 400067

當歸、川芎是養(yǎng)血活血的常用傳統(tǒng)中藥，也是中成藥制劑的常用藥材。在《中國藥典》2005年版一部中[1]，僅含當歸的中成藥制劑有52個品種，僅含川芎的中成藥制劑有36個品種，當歸和川芎都含有的制劑有47個品種，含有當歸、川芎藥材的中成藥制劑品種在《中國藥典》2005年版中數(shù)量占23.9%，因而當歸、川芎成為了《中國藥典》2005年版中用量最廣泛的常用藥材?，F(xiàn)常用阿魏酸和川芎嗪作為當歸、川芎的指標檢測成分，但實際上當歸、川芎中藁本內(nèi)酯含量遠高于阿魏酸和川芎嗪在藥材中的含量[2-6]。據(jù)文獻報道藁本內(nèi)酯在當歸、川芎中分別高達2.689%[7]、1.857%[8]，因此藁本內(nèi)酯為當歸、川芎中含量最高的活性成分。已有大量研究報道藁本內(nèi)酯對心血管系統(tǒng)有較強藥理活性[9-11]，其可解除血管痙攣、增加冠脈流量、擴張微血管等，這些作用符合當歸、川芎活血化瘀的藥理功效。因此，將藁本內(nèi)酯作為含當歸、川芎中成藥中活性檢測成分是最有科學(xué)依據(jù)的。但由于藁本內(nèi)酯結(jié)構(gòu)特殊穩(wěn)定性差[12-13]，其藁本內(nèi)酯對照品制備難，保存更難[14]，現(xiàn)還未有文獻報道中成藥制劑中的藁本內(nèi)酯檢測分析。筆者在用HPLC測定川芎中藁本內(nèi)酯研究的基礎(chǔ)上[8]，用自制穩(wěn)定的藁本內(nèi)酯對照品建立了藁本內(nèi)酯的薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜（HPLC）檢測分析方法，分別對含當歸、川芎的代表性中成藥制劑中藁本內(nèi)酯進行定性和定量分析檢測，為此類藥材復(fù)方制劑的分析檢測、質(zhì)量控制和臨床治療用藥監(jiān)測提供參考。

1 儀器與試藥

TU-Ⅱ暗箱式紫外觀察儀（內(nèi)置254 nm/366 nm紫外光燈管，上?？普苌萍加邢薰荆籄gilent 1260型液相色譜儀（帶四元泵、自動進樣器、UV檢測器，安捷倫科技有限公司）；超聲波清洗儀（SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；梅特勒AG204電子天平；Nikon數(shù)碼相機（D700，日本尼康公司）；Milli-Q純水儀；Eppendorf 5417C高速離心機。

防風通圣丸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號：100401）；妙濟丸（陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司，批號：100803）；心通口服液（魯南厚普制藥有限公司，批號：10062007）；天麻丸（重慶桐君閣藥廠有限公司，批號：10070002）；十全大補丸（重慶中藥二廠，批號：1002001）；黃氏響聲丸（無錫濟民藥業(yè)股份有限公司，批號：110616）；木瓜片（吉林亞泰明星制藥有限公司，批號：20101101）；止痛化癥片（江西杏林白馬藥業(yè)有限公司，批號：20100706）；石斛夜光丸（長春人民藥業(yè)集團有限公司，批號：111207）；川芎茶調(diào)濃縮丸（重慶中藥二廠有限公司，批號：1012026）；補腎益腦丸（牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司，批號：100802）；逍遙丸（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號：091213）；黃連上清丸（四川綿陽制藥有限公司，批號：55110016）；九味羌活丸（四川綿陽制藥有限公司，批號：55110042）；烏雞白鳳丸（江西民濟藥業(yè)有限公司，批號：100612）；人參再造丸（吉林天強制藥有限公司，批號：1000901）。甲醇（美國Merck公司）為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。藁本內(nèi)酯對照品（自制，經(jīng)核磁共振氫譜和碳譜鑒定，其純度以HPLC和GC測定，按面積歸一化法計算大于98.0%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC檢測分析

2.1.1 樣品溶液制備 取各中成藥用研缽研磨成細末狀，分別稱取2 g各藥細末加入10 mL的甲醇溶解，再用超聲波清洗機分別超聲30 min，離心，取上清液作為供試樣品，備用。稱取藁本內(nèi)酯對照品10 mg加入10 mL甲醇溶解，作為對照樣品，備用。

2.1.2 色譜條件 以HF254硅膠板為固定相，以石油醚∶乙酸乙酯（10∶1）為展開劑，在層析缸中充分飽和，展開，取出晾干，在TU-Ⅱ暗箱式紫外儀254 nm和365 nm波長下視檢，用數(shù)碼相機照相，記錄色譜圖。

2.1.3 檢測結(jié)果 取上述制備好的各供試樣品和藁本內(nèi)酯對照品液，點樣于一塊長HF254硅膠板上，飽和，展開，記錄色譜圖，藁本內(nèi)酯的Rf值為0.52，總色譜見圖1。

圖1 各中成藥TLC圖譜

從圖 1 可看出 2、3、7、8、13、15、16 在藁本內(nèi)酯對照品點處沒有類似的熒光斑點，說明這幾個中成藥制劑中TLC檢測不到當歸、川芎的有效成分藁本內(nèi)酯，可以初步判斷這幾個制劑中當歸、川芎的藥材加入量很低或沒有加入正品當歸、川芎藥材。

2.2 HPLC含量檢測

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取藁本內(nèi)酯對照品5.3 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成濃度為106 μg/mL標準溶液，備用。

2.2.2 樣品溶液制備 取各中成藥用研缽研磨成細末狀，分別稱取2 g各藥細末，加入20 mL甲醇，共加兩次，超聲提取30 min，過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，得到各樣品溶液，備用。

2.2.3 色譜條件[8]Agilent 1260型液相色譜儀（四元泵、自動進樣器、UV 檢測器）；色譜柱：Hypersil ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-5%異丙醇（45∶55）；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25℃。在此條件下，樣品中的藁本內(nèi)酯與其他峰均能達到基線分離，藁本內(nèi)酯的保留時間為12.1 min，對照品和樣品的色譜見圖2～4，其中樣品圖隨機選擇11和15號。

2.2.4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液，用流動相稀釋制成含藁本內(nèi)酯 1.06、5.30、10.60、21.20、53.00 μg/mL 的系列溶液。按“2.2.3”項下色譜條件，分別準確進樣10 μL，測定，記錄各自峰面積。以對照品重量（μg）為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y，得藁本內(nèi)酯線性回歸方程為：Y=2485.2X+19.943（r=0.9990，n=5），結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯含量在 1.06～53.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 取同一樣品（11號補腎益腦丸）溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進樣10次，每次10 μL，測定藁本內(nèi)酯峰面積，RSD為0.78%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一樣品（11號補腎益腦丸）溶液，分別于 0、2、4、6、8 h，按上述色譜條件，分別進樣 10 μL，測定藁本內(nèi)酯峰面積，其RSD為0.93%，表明樣品溶液在至少8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重現(xiàn)性考察 分別稱取2 g同一中成藥粉末（11號補腎益腦丸）5份，按“2.2.2”項下樣品溶液制備方法制備5份供試液，按上述色譜條件，分別各進樣10 μL，測定藁本內(nèi)酯峰面積，其RSD=0.95%，表明該分析方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.8 回收率實驗 分別稱取1 g同一中成藥粉末（11號補腎益腦丸）6份，分別精密加入106 μg/mL藁本內(nèi)酯對照品溶液各 0.5、0.5、1.0、1.0、2.0、2.0 mL，按“2.2.2”項下樣品溶液制備方法制備加樣回收供試品溶液，并按“2.2.3”項下色譜條件進行測定，計算回收率，結(jié)果藁本內(nèi)酯的平均回收率為99.20%，其RSD為0.53%，結(jié)果見表1。

表1 藁本內(nèi)酯加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品測定 分別取“2.2.2”項下制備好的各樣品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件，進樣 10 μL，測定，記錄藁本內(nèi)酯峰面積，用外標法計算其藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表2。

表2 各中成藥中藁本內(nèi)酯的含量測定結(jié)果（n=3）

從表2可以看出3、7、8號中成藥中藁本內(nèi)酯含量為0，此結(jié)果與薄層色譜中3、7、8沒有檢測到藁本內(nèi)酯斑點相吻合；在2、13、15、16號樣品中成藥中檢測到藁本內(nèi)酯含量比起其他中成藥要低約10倍，此與薄層色譜中2、13、15、16號樣品幾乎檢測不到藁本內(nèi)酯斑點的結(jié)果也相吻合；其他各中成藥中藁本內(nèi)酯的含量各有不同。

3 討論

據(jù)文獻研究報道[13]藁本內(nèi)酯純品的穩(wěn)定性較差，特別是在室溫下放置極易異構(gòu)化。本實驗參閱文獻[8]并通過反復(fù)驗證，發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯在甲醇中穩(wěn)定性良好，因而選用甲醇為各中成藥的提取溶劑。本實驗對藁本內(nèi)酯薄層層析條件進行了系統(tǒng)的篩選，最終選用硅膠HF254板為吸附劑，以常用的紫外光燈為檢測手段，以毒性很低、價格便宜的石油醚和乙酸乙酯系統(tǒng)為展開劑，該系統(tǒng)對藳本內(nèi)酯有較好的展開分離。此方法簡單方便，快捷低毒，十分適合于中成藥中藁本內(nèi)酯的快速定性檢測。在建立HPLC方法時，筆者在參照前期建立HPLC測定川芎中藁本內(nèi)酯研究的基礎(chǔ)上[8]，進一步對色譜條件及其方法學(xué)進行了系統(tǒng)考察研究，證實所選的色譜系統(tǒng)適用性好，結(jié)果可靠，其方法適用于成分復(fù)雜的中成藥中藁本內(nèi)酯的定量分析檢測。

法定的當歸、川芎藥材檢測指標成分是阿魏酸和川芎嗪，但在其藥材中阿魏酸和川芎嗪的含量遠低于藁本內(nèi)酯，因此檢測藁本內(nèi)酯才能更加真實反應(yīng)出中成藥中當歸、川芎的含量情況。本實驗選用市面上含川芎、當歸的常用中成藥，對比薄層層析定性檢測和高效液相定量檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)薄層層析沒能檢測出藁本內(nèi)酯的中成藥，在高效液相色譜法卻能夠檢測到微量的藁本內(nèi)酯，因此在此類藥品鑒定中不僅要定性檢測藁本內(nèi)酯，也需要對其進行定量分析。本文最終建立了藁本內(nèi)酯在中成藥中的薄層色譜定性檢測和高效液相色譜的定量分析方法，方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，適用于藁本內(nèi)酯的檢測分析，為含川芎、當歸成分的中成藥中藁本內(nèi)酯的含量測定提供了參照，也為該類中成藥質(zhì)量控制提供了新的檢測方法。

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