李延雪 孫 菲 邵禮梅

黑龍江省雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 雞西 158100

復(fù)方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根四味中藥經(jīng)適宜加工方法制成的中藥口服制劑，收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科肺系（一）分冊(cè)[1]，具有辛涼解表，清熱解毒的功效，用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，連翹是一種廣譜而有效的抗微生物藥物，體外試驗(yàn)對(duì)許多種細(xì)菌有抑制作用，連翹對(duì)某些真菌亦有抑制作用。連翹苷作為連翹的主要成分，測(cè)定連翹苷的含量具有一定的意義。其原標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有連翹的含量測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)，為完善質(zhì)量控制方法，參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-8]以連翹苷為測(cè)定指標(biāo)，建立了復(fù)方芩蘭口服液中連翹苷含量測(cè)定的高效液相色譜（HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀（島津）：LC-2010紫外檢測(cè)器，在線(xiàn)脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，LC solution色譜工作站，色譜柱為 Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ-400KDE型高功效數(shù)控超聲波清洗器，AG-285電子分析天平，TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品連翹苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110821-200609）；復(fù)方芩蘭口服液（批號(hào)：20110907、20110908、20110909）；中性氧化鋁（上海陸都化學(xué)試劑廠(chǎng)；粒度：100～200目；層析用）；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取經(jīng)減壓干燥12 h的連翹苷對(duì)照品10.32 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇約60 mL超聲10 min，加50%甲醇至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5支混合均勻，精密量取本品 1 mL，加在中性氧化鋁柱（粒度：100～200 目，6 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用70%乙醇40 mL洗脫，收集洗脫液，將洗脫液置水浴上蒸干，殘?jiān)?0%甲醇3 mL，溫?zé)崾谷芙猓D(zhuǎn)移至5mL量瓶中用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺連翹的陰性樣品，參照供試品溶液的制備方法，制得缺連翹的陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2“項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，陰性對(duì)照溶液色譜圖中則無(wú)此峰，表明在該條件下，陰性樣品不干擾連翹苷的測(cè)定，見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方芩蘭口服液HPLC色譜圖

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 得回歸方程為 Y=6.2935×103X＋1.6672×103，r=1.0000（n=5）。表明連翹苷在 20.64～206.40 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測(cè)定連翹苷峰面積，連翹苷峰面積平均值為326389，RSD為0.74%（n=5），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該條件下儀器精密度良好。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別精密量取樣品（批號(hào)：20110909）6份，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果連翹苷的平均含量為 0.493 mg/mL，RSD=0.68%（n=6），表明方法重現(xiàn)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液 （批號(hào)：20110909），分別于配制后 0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果連翹苷的峰面積RSD=0.97%（n=7），表明供試品溶液在配制后24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)：20110909，連翹苷含量為0.493 mg/mL）6份，每份精密量取本品0.5 mL，以?xún)煞轂橐唤M，共三組，每組分別精密加入連翹苷0.3955、0.4935、0.5920 mg，按供試品溶液的制備方法制備并測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取市售三批樣品，按供試品溶液的制備方法制備溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算連翹苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取連翹苷對(duì)照品適量，用50%甲醇稀釋到一定的濃度，按照紫外分光光度法，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，連翹苷的最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，所以選擇278 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

表2 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3.2 供試品溶液的制備

曾采用50%的甲醇稀釋?zhuān)瑸V過(guò)，直接進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果連翹苷不能完全分離出來(lái)，干擾峰較多，參照《中國(guó)藥典》2010年版一部[9]，用中性氧化鋁小柱處理樣品，能有效去除雜質(zhì)的干擾。

3.3 流動(dòng)相的選擇

為了達(dá)到良好的分離效果，曾采用不同濃度的甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行分離，結(jié)果表明乙腈-水（25∶75）作為流動(dòng)相，分離效果最好。

3.4 可用于含量測(cè)定

連翹作為復(fù)方芩蘭口服液中的主要成分，測(cè)定連翹苷的含量具有一定的意義。本法靈敏度高，重復(fù)性好，可用于控制該制劑的質(zhì)量。

[1]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編[S].內(nèi)科肺系（一）分冊(cè)，2002：217-219.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典（上冊(cè)）[M].2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1552-1555.

[3]張濤，陳學(xué)松.連翹不同炮制品中連翹苷的HPLC測(cè)定[J].中草藥，2005，36（9）：1339-1340.

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[5]韓桂茹，龐國(guó)勛.連翹苷檢測(cè)波長(zhǎng)的研究[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（3）：71-73.

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[7]陸紅柳，譚喜瑩，張飛，等.連翹中連翹苷HPLC測(cè)定方法的改進(jìn)[J].中草藥，2007，38（6）：936-937.

[8]韓莉.連翹中連翹苷含量測(cè)定方法的試驗(yàn)研究[J].齊魯藥亊，2008，27（3）：153-154.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：611-612.