孫 虎， 王 平

(山東省中醫(yī)藥研究院藥理研究室，山東濟(jì)南250014)

烏頭為毛茛科烏頭屬植物［1］。烏頭堿具有很高的藥用價(jià)值，廣泛用于治療多種疾病，在強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面已顯示了良好的應(yīng)用基礎(chǔ)［2］。然而因其口服毒性較大，臨床應(yīng)用受限而使基礎(chǔ)研究非常薄弱［3］。烏頭堿可以透過(guò)皮膚被吸收［4］，直接作用于治療部位，提高了藥物的生物利用度和使用安全性［5］。經(jīng)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)烏頭堿的外用限量，烏頭堿類中藥在外用時(shí)沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，只能憑醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)設(shè)定給藥劑量，存在極大的安全隱患，同時(shí)烏頭堿極易在組織腐敗和堿性環(huán)境下被破壞，因而尸檢時(shí)難以檢測(cè)［6］。特別是關(guān)于烏頭堿中毒的試驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少。通過(guò)烏頭堿透皮給藥的急性毒性試驗(yàn)，為臨床安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半 (購(gòu)自山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):魯動(dòng)質(zhì)scxk(魯)20090001號(hào))。試驗(yàn)室溫度為23～28℃，相對(duì)濕度50% ～70%，通風(fēng)良好，喂以專用顆粒鼠飼料 (飼料:山東省試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 藥品與試劑 烏頭堿化學(xué)對(duì)照品 (純度≥98.0%，HPLC)(由北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院提供，編號(hào):BW5271)。取適量烏頭堿溶于60%乙醇溶液中，混勻，根據(jù)試驗(yàn)需要制成各種劑量溶液。冰醋酸 (分析純)(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào):110274)。60%乙醇溶液 (江津白酒廠出品，批號(hào):060923)。

1.4 儀器 YB—6LF生物組織石蠟包埋機(jī)、YT—7F型生物組織攤烤片機(jī)、ZT—12P生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司;LEICA—RM2135切片機(jī)、LEICA—DM/LS顯微鏡，德國(guó)LEICA公司。

2 方法

2.1 急性毒性試驗(yàn)給藥劑量篩選、急性毒性試驗(yàn)根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)給藥劑量篩選和急性毒性試驗(yàn)。首先取昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分組，每組5只。試驗(yàn)小鼠給藥前12 h，禁食不禁水。試驗(yàn)采用小鼠外耳涂搽方式給藥。給藥后立即觀察和記錄試驗(yàn)小鼠的中毒癥狀及死亡情況。給藥1 d后未死亡的動(dòng)物按《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》描述的觀察指征連續(xù)觀察2周。各組小鼠于外耳處分別涂搽質(zhì)量濃度為5.00、4.50、4.05、3.65、3.28 mg/mL烏頭堿乙醇溶液;給藥量分別為 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL/kg，空白對(duì)照組，在相同部位給予等劑量的賦形劑，記錄各組小鼠給藥后的活動(dòng)及死亡情況;根據(jù)劑量篩選試驗(yàn)，確定以烏頭堿3.00 mg/mL為初質(zhì)量濃度，以0.85為等比系數(shù)向下稀釋6個(gè)等級(jí)，給藥容積為10.0 mL/kg，方法同上，每組10只，按照均衡隨機(jī)原則分為30.00、25.50、21.70、18.40、15.60 mg/kg 5 個(gè)劑量組，剪取最高致死劑量、最低致死劑量和空白組的小鼠解剖，將取出小鼠心臟和腦組織，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、固定、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下作組織病理學(xué)觀察。

2.2 最小致死量以下累積透皮給藥的毒性試驗(yàn)取昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，在最小致死劑量15.60 mg/kg下選取3個(gè)劑量［7-8］，隨機(jī)分為10.00、12.50、15.00 mg/kg和空白對(duì)照4個(gè)劑量組，每組10只。分別每日給予各組小鼠外耳處涂搽烏頭堿乙醇溶液，累積給藥10 d，觀察小鼠活動(dòng)情況和死亡情況。

2.3 累積透皮給藥對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響取18～22 g健康小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，按高、中、低、陽(yáng)性藥、空白組分別于外耳處涂搽烏頭堿藥液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.50、18.75、15.00 mg/kg的烏頭堿液、扶他林、水，分別給藥每日1次，連續(xù)給藥3 d。第3天藥后30 min，各只小鼠腹腔注射0.2 mL冰醋酸，觀察15 min內(nèi)扭體次數(shù)及扭體潛伏期，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 劑量篩選試驗(yàn)、急毒試驗(yàn)結(jié)果 給藥10 min左右，部分小鼠出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為身體僵直、活動(dòng)劇烈、躁動(dòng)不安、惡心、呼吸急促、顫抖，隨后出現(xiàn)少動(dòng)、四肢無(wú)力、走路搖晃、便溏;部分動(dòng)物出現(xiàn)死亡。死亡小鼠的尸體表現(xiàn)為窄息征象，尸斑呈暗紫紅色，口唇和指甲紫紺，有時(shí)口角可見(jiàn)流涎痕跡。解剖可見(jiàn)各臟器均表現(xiàn)出水腫，未見(jiàn)明顯特異性毒理學(xué)變化。出現(xiàn)中毒癥狀但未死亡動(dòng)物第2天仍舊便溏，第3天基本恢復(fù)，活動(dòng)趨于正常，飲水吃食正常。繼續(xù)觀察2周未出現(xiàn)新的異常。表1結(jié)果顯示，當(dāng)小鼠給予烏頭堿劑量在27.34 mg/kg及以上時(shí)，小鼠全部死亡，在27.34 mg/kg時(shí)死亡3只，在25.00 mg/kg時(shí)死亡4只，在22.50 mg/kg時(shí)死亡2只，在20.25 mg/kg時(shí)死亡1只，在 18.23 mg/kg時(shí)死亡 1只，在 16.41 mg/kg及以下時(shí)未見(jiàn)死亡，提示可以以27.34 mg/kg左右的劑量進(jìn)行單次烏頭堿透皮給藥的正式急性毒性試驗(yàn)。

表1 烏頭堿乙醇溶液經(jīng)皮給藥小鼠急性毒性劑量與死亡數(shù)關(guān)系Tab.1 Relationship between mortality and acute toxicity dosage of aconitine ethanol solution transdermal absorption on mice

藥后10 min左右，部分小鼠出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為活動(dòng)劇烈，躁動(dòng)不安，身體僵直，呼吸急促，顫抖，一段時(shí)間后惡心，便溏，活動(dòng)減少。表2顯示，當(dāng)小鼠給予烏頭堿外用劑量在30 mg/kg時(shí)，小鼠死亡率為100%，在25.50 mg/kg時(shí)死亡率為80%，在18.40 mg/kg時(shí)死亡率為20%，在15.60 mg/kg時(shí)死亡率為0。根據(jù)動(dòng)物死亡數(shù)，用Bliss法進(jìn)行計(jì)算，LD50=21.3 mg/kg;LD50的95%可信限為19.6～23.2 mg/kg。正式試驗(yàn)與預(yù)試驗(yàn)中給藥組動(dòng)物的死亡時(shí)間比較一致，主要發(fā)生在給藥后6～24 h。

表2 烏頭堿乙醇溶液經(jīng)皮給藥途徑小鼠急性毒性試驗(yàn)Tab.2 Acute toxicity test of aconitine ethanol solution transdermal absorption on mice

出現(xiàn)中毒癥狀但未死亡動(dòng)物大多給藥后第3天活動(dòng)恢復(fù)，恢復(fù)后的小鼠未見(jiàn)抽搐、大小便失禁、嘶叫、煩燥不安或鼻、眼、口大量分泌物等現(xiàn)象，無(wú)異常病理性神經(jīng)反射出現(xiàn)，繼續(xù)觀察2周未出現(xiàn)新的異常。給藥后第14天稱定體質(zhì)量，各組小鼠之間無(wú)顯著性差異。

將存活動(dòng)物大體解剖，觀察到部分小鼠臟器異常，可見(jiàn)壞死、出血、積液等病理改變。最高致死劑量30 mg/kg、最低致死劑量15.6 mg/kg和空白組小鼠的腦及心臟病理檢測(cè)圖1顯示，給藥后小鼠心肌出現(xiàn)心肌斷裂、灶性出血，心肌細(xì)胞出現(xiàn)變形壞死，隨著給藥劑量的加重變性壞死程度進(jìn)一步加重;小鼠神經(jīng)元出現(xiàn)水腫、壞死，周圍出現(xiàn)軟化灶，變性壞死最重的反應(yīng)區(qū)在海馬區(qū)，部分細(xì)胞核出現(xiàn)分離。隨著給藥劑量的加大腦組織變性壞死程度也是進(jìn)一步加重。

3.2 最小致死劑量以下烏頭堿累積透皮給藥對(duì)小鼠的毒性影響 給藥10 min左右，部分小鼠出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為身體僵直、活動(dòng)劇烈、躁動(dòng)不安、惡心、呼吸急促、顫抖，隨后出現(xiàn)少動(dòng)、四肢無(wú)力、走路搖晃、便溏;未見(jiàn)死亡。出現(xiàn)中毒癥狀但未死亡動(dòng)物第2天仍舊便溏，第3天基本恢復(fù)，活動(dòng)趨于正常，飲水吃食正常。3 d以后部分小鼠活動(dòng)反而更加活躍。第10天稱定體質(zhì)量，與空白對(duì)照組相比，給藥組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。處死小鼠，解剖，肉眼觀察各臟器未見(jiàn)異常。烏頭堿最小致死量以下的累積透皮給藥，可致小鼠發(fā)生毒性反應(yīng)，但隨著用藥次數(shù)的增加，毒性反應(yīng)消失，小鼠逐漸恢復(fù)正常，出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)現(xiàn)象”。表3結(jié)果顯示，3個(gè)劑量的烏頭堿累積透皮給藥，小鼠均無(wú)死亡現(xiàn)象。

圖1 病理切片檢查結(jié)果Fig.1 Results of pathological section

表3 烏頭堿乙醇溶液累積經(jīng)皮給藥小鼠死亡情況Tab.3 Death records of mice offered aconitine ethanol solution by accumulatively transdermal absorption

3.3 烏頭堿累積透皮給藥對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響表4結(jié)果顯示，烏頭堿各劑量組均能顯著延長(zhǎng)0.6%醋酸所致小鼠扭體的潛伏期并減少扭體次數(shù)。潛伏期比較，高、中劑量組與空白對(duì)照組相比有顯著性差異，扶他林組與空白對(duì)照組相比有非常顯著性差異，低劑量組與扶他林組相比有顯著性差異;扶他林組與空白對(duì)照組比較，扭體次數(shù)有顯著性差異。通過(guò)潛伏期和扭體次數(shù)的比較可以發(fā)現(xiàn)，中劑量組鎮(zhèn)痛效應(yīng)接近高劑量組，提示當(dāng)用量達(dá)到18.75 mg/kg時(shí)，烏頭堿鎮(zhèn)痛作用達(dá)到平臺(tái)期。

表4 烏頭堿對(duì)0.6%醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)Tab.4 Aconitine's influence on twisting response for 0.6%acetic acid-induced mice(±s，n=10)

表4 烏頭堿對(duì)0.6%醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)Tab.4 Aconitine's influence on twisting response for 0.6%acetic acid-induced mice(±s，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊＊P＜0.001;與扶他林組比較，#P ＜0.05。

扭體次數(shù)空白對(duì)照組組 別 烏頭堿劑量/(mg·kg－1) 潛伏期/s 330±30.5 35.60±2.40高劑量組 22.50 618±28.1* 17.40±5.68中劑量組 18.75 610±26.3* 16.50±4.86低劑量組 15.00 568±21.7# 24.90±5.78扶他林組 26.00 771±17.4＊＊＊ 9.20 ±3.71－*

4 討論

中藥的毒性是中藥藥性理論的核心之一，歷來(lái)是一個(gè)重要的研究方向。辯證看待中藥的毒性，辨證準(zhǔn)確，配伍得當(dāng)，便能化毒為利，正如《醫(yī)法園通》中所講“病之當(dāng)服，附子、大黃、砒霜，皆是至寶;病之不當(dāng)服，參、芪、鹿茸、枸杞，都是砒霜”。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為，中藥治病基本原理在于其藥物都具有各自的偏性，藥物之所以能夠治病，就是利用其偏性來(lái)祛除病邪，消除病因，協(xié)調(diào)臟腑功能，糾正機(jī)體陰陽(yáng)偏盛偏衰，使機(jī)體恢復(fù)正常，因此以偏糾偏是中藥治療疾病的基本原理［9］?；谝陨侠碚?，毒性是烏頭堿的偏性，亦為其有效性。

本試驗(yàn)通過(guò)考察烏頭堿外用急性毒性，得到烏頭堿單次給藥的半數(shù)致死量LD50為21.3 mg/kg;LD50的95%可信限為19.6～23.2 mg/kg;在最小致死量以下選取3個(gè)藥物劑量進(jìn)行烏頭堿累積外用考察，發(fā)現(xiàn)累積給藥后小鼠仍舊發(fā)生毒性反應(yīng)，但是隨著用藥次數(shù)的增加，毒性反應(yīng)出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)現(xiàn)象”。同時(shí)，根據(jù)大體解剖中肉眼觀察的病變和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷可能的毒性靶器官是腦和心臟［10-12］。

在累積外用烏頭堿對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛作用試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)烏頭堿鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度隨著用藥量的增加而加強(qiáng);通過(guò)潛伏期和扭體次數(shù)的比較可以發(fā)現(xiàn)，中劑量組鎮(zhèn)痛效應(yīng)接近高劑量組，提示當(dāng)用量達(dá)到18.75 mg/kg時(shí)，烏頭堿鎮(zhèn)痛作用達(dá)到平臺(tái)期。研究表明烏頭堿在外用鎮(zhèn)痛方面有其獨(dú)到之處，對(duì)慢性疼痛的止痛效果并不低于西藥［13］，對(duì)中樞和外周疼痛都有抑制作用［14］，其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，且連續(xù)用藥不易產(chǎn)生耐受現(xiàn)象［15］。本試驗(yàn)通過(guò)探討烏頭堿外用經(jīng)皮給藥的使用限量和鎮(zhèn)痛作用，為今后烏頭堿類中藥的臨床安全使用和基礎(chǔ)研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

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