王 蕾， 苗淑杰， 李 旭， 種影影， 王 佳， 陳衛(wèi)平

(1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020;2.天津同仁堂股份有限公司，天津300381)

腎炎康復(fù)片是天津同仁堂股份有限公司研制的國(guó)家級(jí)新藥，主治慢性腎小球腎炎屬于氣陰兩虛、脾腎不足、毒熱未消證者，表現(xiàn)為神疲乏力，腰腿酸軟，面浮腳腫，頭暈耳鳴，蛋白尿，血尿等。有臨床報(bào)道，腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病 (DN)亦有明顯治療作用，可有效控制血糖［1］，減少尿蛋白排泄量，減輕水腫癥狀［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，觀察腎炎康復(fù)片對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠的治療作用，并揭示其對(duì)糖尿病腎病病變靶器官腎臟功能改善作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 Wistar大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。許可證編號(hào):SCXK(京)2007-0001。

普通全價(jià)顆粒飼料Ⅱ號(hào)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，京動(dòng)許字 (2000)第015號(hào)。動(dòng)物飲用純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 腎炎康復(fù)片 (由天津同仁堂股份有限公司提供，批號(hào):B81003)，每克藥粉含2.5 g生藥。將腎炎康復(fù)片藥粉用純凈水配制成0.6、0.3、0.15 g生藥/mL的腎炎康復(fù)片藥粉混懸液待用;鹽酸吡格列酮片 (北京太洋藥業(yè)有限公司，批號(hào):070201);鏈脲佐菌素 (STZ)(北京市博愛(ài)科貿(mào)有限責(zé)任公司分裝Sigma-S0130)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 全自動(dòng)生化儀 (SaBa18);紫外分光光度計(jì) (島津UV-260);離心機(jī) (80-1，上海手術(shù)器械廠);恒溫水浴箱 (S648，上海醫(yī)療器械廠);大鼠代謝籠。

1.4 實(shí)驗(yàn)用試劑盒 糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20070713);尿蛋白定量試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào):20070714);肌酐試劑盒測(cè)定法 (中生北控生物科技有限公司，批號(hào):070821);葡萄糖液體試劑盒 (中生北控生物科技有限公司，批號(hào):070861)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及模型的建立［3-5］大鼠經(jīng)背部切口行右腎切除術(shù)，假手術(shù)對(duì)照組僅對(duì)皮膚和肌肉進(jìn)行切開(kāi)、縫合操作，不切除腎臟。2周后，經(jīng)尾靜脈注射 STZ 1次 (35 mg/kg，溶于 pH 4.5、0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中)誘導(dǎo)糖尿病腎病模型，假手術(shù)對(duì)照組僅注射等體積的枸櫞酸緩沖液。72 h后，空腹眼眶內(nèi)眥采血測(cè)血糖，將血糖≥11.1 mmol/L為模型入選標(biāo)準(zhǔn)，然后按照血糖值將大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組、鹽酸吡格列酮10 mg/kg對(duì)照藥組、腎炎康復(fù)片6、3、1.5 g生藥/kg三個(gè)劑量組，相當(dāng)于臨床人用劑量的30、15、7.5倍。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 各組大鼠每日灌胃相應(yīng)藥物1次/d，給藥體積10 mL/kg，假手術(shù)與模型對(duì)照組分別灌胃等體積純凈水，共11周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，代謝籠收集24 h尿液，量取尿量后，2000 r/min離心10 min，去沉淀，－20℃保存待測(cè)尿肌酐、尿蛋白水平。用戊巴比妥鈉 (45 mg/kg)腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血測(cè)定血糖、糖化血紅蛋白、血清肌酐、血清尿素氮。取左側(cè)腎臟，剝離被膜后，用17%的福爾馬林液固定，常規(guī)制片，光鏡檢查，測(cè)量腎小球直徑和面積。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法 所得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件多組間方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖、糖化血紅蛋白的影響 糖尿病腎病模型對(duì)照組Glu和HbA1c與假手術(shù)對(duì)照組比較明顯升高 (P＜0.001，P＜0.001);腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg組大鼠Glu和HbA1c比模型對(duì)照組明顯降低 (P＜0.01，P＜0.05)。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖、糖化血紅蛋白的影響(±s)Tab.1 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on Glu，HbA1c in rats(±s)

表1 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖、糖化血紅蛋白的影響(±s)Tab.1 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on Glu，HbA1c in rats(±s)

注:模型對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組t檢驗(yàn)，△△△P＜0.001;各給藥組與模型對(duì)照組方差分析，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù)/只(mmol·L )(HbA1c)/(g·mL )10 8.60± 2.20 28.24±3.0810 28.18±10.93△△△ 37.73±2.58△△△10 24.21± 9.72 33.82±2.70★10 12.42± 8.05★★ 33.90±2.87★10 22.71±12.82 35.26±3.6010 18.09± 9.35 34.90±2.90血糖(Glu)/－1糖化血紅蛋白－1假手術(shù)對(duì)照組腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg組模型對(duì)照組鹽酸吡格列酮10 mg/kg組腎炎康復(fù)片1.5 g生藥/kg組腎炎康復(fù)片3 g生藥/kg組

3.2 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能的影響糖尿病腎病模型對(duì)照組血清BUN、Scr水平明顯升高 (P＜0.001，P＜0.01)，表明腎功能受到嚴(yán)重?fù)p害;腎炎康復(fù)片6 g、1.5 g生藥/kg組Scr較模型對(duì)照組明顯降低 (P＜0.05，P＜0.05)，各劑量組血清BUN均有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 對(duì)大鼠血清尿素氮、血清肌酐的影響(±s)Tab.2 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on BUN，Scr in rats(±s)

表2 對(duì)大鼠血清尿素氮、血清肌酐的影響(±s)Tab.2 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on BUN，Scr in rats(±s)

注:模型對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組t檢驗(yàn)，△△P＜0.01，△△△P＜0.001;各給藥組與模型對(duì)照組方差分析，★P＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù)/只血清尿素氮(BUN)/(mmol·L －1)血清肌酐(Scr)/(mmol·L －1)假手術(shù)對(duì)照組10 21.40± 8.66 98.20±10.04腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg組10 5.70± 1.44 90.20± 6.66模型對(duì)照組 10 25.62± 8.67△△△ 107.60±15.59△△鹽酸吡格列酮10 mg/kg組10 17.16±10.53 100.90±14.74腎炎康復(fù)片1.5 g生藥/kg組10 19.08± 9.71 92.80± 9.45★腎炎康復(fù)片3 g生藥/kg組10 17.33± 6.82 91.10± 6.35★

糖尿病腎病大鼠尿量明顯增加 (P＜0.01)、尿肌酐水平明顯降低 (P＜0.05)、尿蛋白水平明顯增加 (P＜0.01)，表明其腎功能損害，肌酐清除功能降低，腎小球?yàn)V過(guò)膜功能和腎小管重吸收功能障礙使蛋白分子隨尿液排出，形成蛋白尿。腎炎康復(fù)片各劑量組可使糖尿病腎病大鼠尿量減少、使尿肌酐水平有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg可使糖尿病腎病大鼠尿中蛋白水平明顯降低 (P＜0.05)。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

3.3 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織形態(tài)的影響 與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組腎臟病變顯著，多數(shù)腎小球直徑明顯增大，可見(jiàn)腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生;多數(shù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性明顯，尤以遠(yuǎn)曲小管為著。與模型對(duì)照組比較，給藥組均有不同程度改善，腎病變顯著減輕;多數(shù)動(dòng)物腎小球直徑增大不明顯，腎小管空泡變性范圍亦明顯縮小。腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg組改善作用更為顯著。數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表3 腎炎康復(fù)片對(duì)大鼠尿量、尿肌酐、尿蛋白的影響(±s)Tab.3 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on VOL，Cr，Pro in rats(±s)

表3 腎炎康復(fù)片對(duì)大鼠尿量、尿肌酐、尿蛋白的影響(±s)Tab.3 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on VOL，Cr，Pro in rats(±s)

注:模型對(duì)照組與假手術(shù)對(duì)照組t檢驗(yàn)，△P＜0.05，△△P＜0.01;各給藥組與模型對(duì)照組方差分析，★P＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù)/只 尿量(VOL)/mL 尿肌酐(Cr)/(mol·L－1) 尿蛋白(Pro)/(ng·h－1·24－1)10 43.40±44.19 2558.60±1818.40 31.33±31.93模型對(duì)照組 10 115.30±62.10△△ 1019.40±295.46△ 102.33±52.33△△鹽酸吡格列酮10 mg/kg組 10 133.00±29.76 1010.60±328.58 93.84±24.12腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg組 10 79.44±26.80 1605.90±1288.47 54.69±25.35★腎炎康復(fù)片3 g生藥/kg組 10 110.30±33.01 1129.20±215.07 78.21±29.07腎炎康復(fù)片1.5 g生藥/kg組假手術(shù)對(duì)照組10 98.10±32.29 1198.70±352.83 71.13±25.39

表4 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理的影響Tab.4 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on kidney pathology in rats(±s)

表4 腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理的影響Tab.4 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on kidney pathology in rats(±s)

注:假手術(shù)對(duì)照組與模型對(duì)照組t檢驗(yàn)，△P＜0.05;各給藥組與模型對(duì)照組方差分析，★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001。

組 別 動(dòng)物數(shù)/只指標(biāo)腎小球直徑/μm腎小球面積/(×102×μm2)假手術(shù)對(duì)照組10 90.9 ±6.3 74.6 ±11.7模型對(duì)照組 10 119.3 ±11.2△ 115.9 ±23.8△鹽酸吡格列酮10 mg/kg組 10 100.0±10.6★★★ 88.0 ±15.1★★腎炎康復(fù)片6 g生藥/kg組 10 104.3±8.4★★ 99.6±13.2腎炎康復(fù)片3 g生藥/kg組 10 115.5±5.8 113.0±4.8腎炎康復(fù)片1.5 g生藥/kg組 10 108.8±7.0★106.0 ±13.1

4 討論

糖尿病腎病是臨床常見(jiàn)和多發(fā)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，主要指糖尿病腎小球硬化癥，是以血管損害為主的腎小球病變。糖尿病早期腎體積增大，腎小球?yàn)V過(guò)率增加，呈高濾過(guò)狀態(tài)，以后逐漸出現(xiàn)間隙蛋白尿或微量白蛋白尿，隨著病程的延長(zhǎng)出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球?yàn)V過(guò)率降低，進(jìn)而可以發(fā)展為腎功能不全、尿毒癥。

實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病可通過(guò)對(duì)大鼠體內(nèi)注射鏈脲佐菌素 (STZ)進(jìn)行復(fù)制，STZ的作用是破壞胰島β細(xì)胞，使其喪失分泌功能，隨著病程的進(jìn)展形成糖尿病腎病。常用STZ腹腔注射劑量為60 mg/kg［6-9］，但造模周期較長(zhǎng)，若合并一側(cè)腎臟全部或部分切除術(shù)，可縮短實(shí)驗(yàn)周期，并減少STZ用量，使模型得以優(yōu)化［10-11］。本實(shí)驗(yàn)采用右側(cè)腎臟全切術(shù)合并STZ 35 mg/kg靜脈注射的方法制備糖尿病腎病大鼠模型。糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦等典型糖尿病消耗體征，血糖值和糖化血紅蛋白明顯升高，且11周內(nèi)保持穩(wěn)定，腎功能損傷明顯，血肌酐、尿素氮明顯升高，尿蛋白排泄量異常增高，尿肌酐明顯降低，光鏡下可見(jiàn)腎小球直徑明顯增大，基底膜增生增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹。以上大鼠體征和數(shù)據(jù)表明，該方法制備的實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病模型是成功的，其癥狀明顯，生化指標(biāo)穩(wěn)定，組織病理改變與臨床糖尿病腎病病變機(jī)理模擬相似度較高，該方法可用于觀察藥物對(duì)糖尿病腎病的治療及作用機(jī)制研究。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病大鼠治療作用是肯定的，其作用特點(diǎn)可從以下幾方面分析:(1)降糖作用，有效控制血糖是防止和延緩糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。高血糖可引起腎臟一系列病理生理改變，包括糖化產(chǎn)物增加，腎小球?yàn)V過(guò)率增高，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，蛋白激酶和轉(zhuǎn)化因子增強(qiáng)，這些都是導(dǎo)致腎小球損害的主要因素。除血糖指標(biāo)之外，HbA1c亦是重要的糖尿病監(jiān)控指標(biāo)。HbA1c是血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，該產(chǎn)物的結(jié)合是不可逆反應(yīng)，并與血糖濃度成正比，且保持120 d左右，所以HbA1c最重要的意義在于，它可反映糖尿病患者近8～12周的血糖控制情況，不受偶爾一次血糖升高或降低的影響，現(xiàn)已作為國(guó)際公認(rèn)的糖尿病監(jiān)控“金標(biāo)準(zhǔn)”。腎炎康復(fù)片可使糖尿病腎病大鼠Glu和HbA1c有效降低，針對(duì)高血糖癥這一最基本因素起到有效調(diào)控作用，是其延緩和治療腎臟并發(fā)癥的前提和先決條件。(2)改善腎功能，針對(duì)糖尿病并發(fā)的腎臟病變，腎炎康復(fù)片可直接作用于病變靶器官，通過(guò)干預(yù)治療后，糖尿病腎病大鼠多尿、蛋白尿的癥狀均得到改善。血清肌酐明顯低于模型對(duì)照組，尿肌酐的排泄功能亦有所改善，尿蛋白排泄量明顯減少，這些數(shù)據(jù)均表明腎炎康復(fù)片對(duì)腎小球和腎小管的功能起到修復(fù)和改善作用。(3)腎臟組織形態(tài)，腎炎康復(fù)片給藥組腎臟病變顯著減輕，減輕程度有明顯劑量—效應(yīng)關(guān)系，6 g/kg組多數(shù)動(dòng)物腎小球直徑增大不明顯，腎小球空泡變性范圍亦明顯縮小，改善效果最明顯，其他劑量組亦有不同程度的修復(fù)作用。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)表明，在實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病的基礎(chǔ)上，可觀察出腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病合并腎損傷有明顯治療作用，在有效控制高血糖癥的同時(shí)，亦能延緩和改善糖尿病腎病的發(fā)展。

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