朱登祥， 安 芳， 王書華

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北張家口075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花Trollius chinensis Bunge的干燥花及花蕾，廣泛分布于西南、西北、華北、東北地區(qū)?！侗静菥V目拾遺》謂其“味苦，性寒，無毒”，可“治口瘡、喉腫、浮熱牙宣、耳疼、目痛”，并具“明目、解嵐障”之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花總黃酮具有抗氧化、抗腫瘤等作用［1-4］。葒草苷在金蓮花總黃酮中較高［5］，屬于黃酮碳苷類化合物，具有抗氧化、對缺血缺氧心肌良好的保護(hù)作用［6-7］，與抗腫瘤作用較強(qiáng)的木犀草素［8］具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。經(jīng)對國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索尚未見金蓮花中葒草苷抗腫瘤作用的研究報(bào)道。本研究在金蓮花總黃酮抗腫瘤研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察葒草苷對人食管癌EC-109細(xì)胞的抗瘤作用，為確立金蓮花黃酮抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為抗腫瘤藥物的研制與開發(fā)提供新的動(dòng)力。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 EC-109細(xì)胞 (購自北京腫瘤研究所遺傳室);細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640(美國Gibico公司);胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司);CCK-8試劑盒 (上海瑪芝佳公司);細(xì)胞凋亡Hoechst染色試劑盒 (晶美生物工程有限公司);Annexin V-FITC試劑盒 (碧云天試劑公司);瓊脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)。全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀 (Spectra Max，美國分子儀器有限公司);凝膠成像系統(tǒng) (BioSpectrumAC system，美國 UVP公司);流式細(xì)胞儀 (FCM，F(xiàn)ACS-Aria美國BD公司);ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡 (日本 Nikon公司);3319型 CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)。

1.2 葒草苷制備及鑒定［9］

1.2.1 葒草苷提取 稱取一定量潔凈、干燥、粉碎的金蓮花，丙酮脫色素，濾渣干燥后，60%乙醇浸泡，回流提取，濾液減壓濃縮、離心，收集上清液，上清液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化，先用4倍體積的蒸餾水洗去雜質(zhì)，再依次用4倍體積的10%、70%、95%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液。洗脫液經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)濃縮、真空干燥成固體。得葒草苷粗品。

1.2.2 高效液相色譜分離純化葒草苷 ZORBAX SB-C18色譜柱 (21.2 mm×250 mm，7 μm);流動(dòng)相為1%乙酸-乙腈 (85∶15);柱溫25℃;體積流量20 mL/min;檢測波長340 nm;進(jìn)樣量6 mL;餾分收集:基于峰，閾值Min為2.2。

將葒草苷粗品用適量流動(dòng)相溶解 (超聲助溶)，過0.45 μm微孔濾膜后，在制備型高效液相色譜條件下進(jìn)樣，將收集得到的葒草苷餾分，減壓濃縮，在－50℃下，真空冷凍干燥，即得淡黃色晶體粉末葒草苷。

1.2.3 高效液相色譜檢測葒草苷純度 Hypersil BDS-C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為1%乙酸-乙腈 (85∶15);檢測波長為340 nm。柱溫30℃。體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。將制備所得葒草苷純品配成一定濃度的供試品溶液 (3份)，按色譜條件進(jìn)行測定 (平行進(jìn)樣5次)。

1.2.4 NMR鑒定葒草苷結(jié)構(gòu) 將制備所得葒草苷經(jīng)NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照。

1.3 葒草苷對EC-109細(xì)胞生長及凋亡的影響

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人食管癌EC-109細(xì)胞于37℃飽和濕度、5%CO2條件下，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期進(jìn)行傳代分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組，空白對照組、溶劑對照組 (葒草苷難溶于水，選DMSO為助溶劑，DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%)、藥物組 (葒草苷終濃度分別為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmol/L)、金蓮花總黃酮為陽性對照組 (質(zhì)量濃度0.793 g/L［3］)。

1.3.2 細(xì)胞生長增殖抑制率檢測 采用CCK-8(cell counting kit)法。取對數(shù)生長期的EC-109細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，取100 μL單細(xì)胞懸液加入96孔板，使每孔細(xì)胞1×105個(gè)。待細(xì)胞貼壁后，輕輕吸去上清，按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的藥物100 μL，達(dá)到終濃度要求。對照組與葒草苷不同濃度組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入藥物，培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長測定吸光度值，計(jì)算藥物對癌細(xì)胞的平均抑制率。

1.3.3 Hoechest33258染色觀察EC-109細(xì)胞形態(tài)EC-109細(xì)胞以每孔900 μL(含5×103細(xì)胞)接種于24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)6 h，細(xì)胞貼壁后加入100 μL不同處理因素，使葒草苷終濃度為5.0，20.0，80.0 μmol/L?？瞻讓φ战M不含處理因素。培養(yǎng)48 h后Hoechst33258染色，以紫外光340 nm波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA Ladder 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL接種于20 mL的培養(yǎng)瓶，2.5 mL/瓶，待細(xì)胞貼壁后，加入藥物，葒草苷終濃度為5.0，20.0，80.0 μmol/L三組，設(shè)空白對照組。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，最后1次移入1.5 mL EP管中，加裂解液615 μL，70℃水浴振蕩15 min，重復(fù)2次，離心取上清液500 μL，加1000 μL的無水乙醇使DNA析出，離心后用20 μL TE緩沖液 (pH7.4)溶解DNA，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳前，用RNA酶 (10 g/L)消化30 min，2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡 實(shí)驗(yàn)分組及藥物作用時(shí)間同1.3.4項(xiàng)。收集對照組及不同濃度藥物作用的EC-109細(xì)胞，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個(gè)，離心，棄上清，用冷PBS洗滌2次，按照Hoechst染色試劑盒的說明操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 葒草苷純度及結(jié)構(gòu)鑒定 高效液相色譜檢測葒草苷樣品純度為98.8%，RSD為1.1%。HNMR鑒定葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品與制備葒草苷樣品活潑氫化學(xué)位移值一致。

2.2 葒草苷對EC-109細(xì)胞生長增殖的抑制作用不同濃度的葒草苷對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制率見表1。

表1 葒草苷對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制作用(±s，n=5)Tab.1 Inhibitory effect of the growth of orientin in EC-109 cell(±s，n=5)

表1 葒草苷對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制作用(±s，n=5)Tab.1 Inhibitory effect of the growth of orientin in EC-109 cell(±s，n=5)

葒草苷/(mol·L －1)抑制率/%24 h 48 h 72 h 5.0 5.23±0.12 10.82±0.23 18.38±0.1610.0 8.03±0.20 21.06±0.32 36.65±0.5620.0 14.35±0.43 30.02±0.88 48.78±0.5840.0 20.43±0.51 36.90±0.67 51.04±0.6680.0 34.08±1.16 44.60±1.45 58.80±1.110.2%DMSO 0.66±0.23 0.58±0.15 0.49±0.44

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示DMSO對細(xì)胞活性及增殖幾乎沒有影響，最大抑制率沒有超過1%，后面實(shí)驗(yàn)不再設(shè)試劑對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一時(shí)相，不同濃度葒草苷對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制率隨著用藥濃度的增高而增高 (P＜0.05)，不同時(shí)相，同一濃度葒草苷對EC-109細(xì)胞抑制率隨時(shí)間延長而增加，具有顯著性差異 (P＜0.05)。前期研究表明，金蓮花總黃酮，質(zhì)量濃度0.793 g/L，作用時(shí)間24 h時(shí)，對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制率為28.00%［3］。本研究表明，當(dāng)葒草苷濃度 80.0 μmol/L(=0.0359 g/L)、作用時(shí)間24 h時(shí)，其對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制率為34.08%，提示葒草苷可能是金蓮花總黃酮中對EC-109細(xì)胞生長增殖抑制作用的藥效物質(zhì)之一，且抗瘤活性優(yōu)于金蓮花總黃酮。

2.3 葒草苷對EC-109細(xì)胞核熒光形態(tài)的影響 空白對照組細(xì)胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，在紫外線下呈均一的藍(lán)色熒光，可見處于分裂期的細(xì)胞。經(jīng)葒草苷處理的細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，即胞體縮小，核染色質(zhì)染色明亮，出現(xiàn)核濃縮、分葉、邊集、核染色質(zhì)碎裂。隨著藥物濃度增大，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多。見圖1。

圖1 葒草苷對EC-109細(xì)胞核形態(tài)的影響 (×400)Fig.1 Affection of orientin in EC-109 cell nuclear shape

2.4 葒草苷對EC-109細(xì)胞DNA的影響 空白對照組沒有出現(xiàn)梯形DNA Ladder(DNA條帶)，而80.0 μmol/L 藥物組，出現(xiàn)明顯 Ladder，20.0 μmol/L、5.0 μmol/L藥物組的條帶較模糊、變暗，但也有較明顯的效果，見圖2。

2.5 葒草苷對EC-109細(xì)胞凋亡率的影響 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法檢測結(jié)果顯示，不同濃度葒草苷均可誘導(dǎo)EC-109細(xì)胞凋亡，其凋亡率隨濃度的增大而增加，且不同濃度葒草苷之間凋亡率相比較有顯著性差異 (P＜0.05);較對照組細(xì)胞凋亡率顯著升高 (P＜0.01)。結(jié)果見表2和圖3。

3 討論

圖2 不同濃度葒草苷對EC-109細(xì)胞的影響Fig.2 Affection of orientin in EC-109 cell

表2 不同濃度葒草苷對EC-109細(xì)胞凋亡的影響 (±s，n=5)Tab.2 Affection of orientin in EC-109 cell apoptosis(±s，n=5)

表2 不同濃度葒草苷對EC-109細(xì)胞凋亡的影響 (±s，n=5)Tab.2 Affection of orientin in EC-109 cell apoptosis(±s，n=5)

樣品 濃度/(mol·L－1) 凋亡率/%0.64±0.12葒草苷 5.0 3.36±0.2020.0 7.21±0.34對照組80.0 28.03±0.64

近年來，許多新藥包括紫杉醇、草酸鉑、伊立替康等應(yīng)用于食管癌的治療。金蓮花黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤等作用，研究金蓮花黃酮單體葒草苷抗腫瘤作用有無及強(qiáng)弱是進(jìn)一步探索金蓮花黃酮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的開始，為抗腫瘤藥物開發(fā)和理論研究打下基礎(chǔ)。

圖3 FCM檢測葒草苷對EC-109細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Detectiong the apoptosis rate of EC-109 cell by FCM

本研究表明，葒草苷在5.0～80.0 μmol/L濃度下，有明顯抑制食管癌細(xì)胞生長增殖的作用，藥物濃度越高、時(shí)間越長，抑制率越高。從時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)走勢來看，同一時(shí)相，高濃度組起初作用明顯，隨濃度增高，抑制率增高，對同一劑量組來說，未呈現(xiàn)劑量-時(shí)間對抑制率的線性正比例關(guān)系。提示，理想的藥物作用濃度應(yīng)該在5.0～80.0 μmol/L之間，癌細(xì)胞生長增殖被抑制。不同時(shí)相，同一濃度葒草苷對EC-109細(xì)胞抑制率為均為20 h＜48 h＜72 h，但未呈現(xiàn)正比例關(guān)系。48 h與24 h、48 h與72 h比較，抑制率均具有顯著性差異，提示，研究EC-109細(xì)胞的早期凋亡，在48 h檢驗(yàn)效果應(yīng)較好。所以后面的三個(gè)檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，藥物作用時(shí)間定在48 h。在細(xì)胞早期凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)DNA可控制降解，形成不同長度的核酸片段，這和細(xì)胞壞死，DNA降解不同，所以DNA Ladder的出現(xiàn)，意味著凋亡的發(fā)生。采用瓊脂糖凝膠電泳與Hoechest33258染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)果顯示葒草苷具有對EC-109細(xì)胞生長抑制效應(yīng)和誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，且呈濃度依賴性關(guān)系。檢測細(xì)胞凋亡，F(xiàn)CM是權(quán)威的檢測手段，其不僅能夠定量分析，還可以區(qū)分統(tǒng)計(jì)壞死的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)CM檢測葒草苷具有誘導(dǎo)EC-109細(xì)胞凋亡作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，隨藥物濃度的增加凋亡的發(fā)生率也隨之增加 (P＜0.05)。值得注意的是，F(xiàn)CM檢測圖顯示，伴隨著凋亡細(xì)胞的增多，死亡細(xì)胞數(shù)目也在同步增加。

綜上分析，葒草苷對EC-109細(xì)胞具有抑制細(xì)胞生長增殖作用，能夠誘導(dǎo)食管癌EC-109細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡。由此可見葒草苷作為一種黃酮碳苷有可能成為一種新型抗食管癌的藥物。

致謝:本實(shí)驗(yàn)葒草苷H-NMR數(shù)據(jù)在中科院化學(xué)所核磁組完成。

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