薛忠文， 董天崴， 張 琦， 徐丁潔， 王 晨， 尚小明*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)，河北石家莊050000;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院，河北唐山063000)

冠心病作為一種系統(tǒng)性纖維增生炎癥性疾病是導(dǎo)致中老年死亡的首要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前我國(guó)約有2000萬人患有冠狀動(dòng)脈性疾?。?］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為冠心病的發(fā)病基礎(chǔ)為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，治療應(yīng)當(dāng)改變不良的生活習(xí)慣，戒煙，低脂飲食，減輕體質(zhì)量，適當(dāng)運(yùn)動(dòng);藥物如辛伐他汀、普伐他汀等副作用及長(zhǎng)期應(yīng)用的安全性有待進(jìn)一步評(píng)估;介入治療仍無法完全克服支架術(shù)后再狹窄、延遲性血栓問題。中醫(yī)藥在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化治療中具有整體論治、辨證分治等特點(diǎn)，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化治療中的一種新選擇。本實(shí)驗(yàn)通過研究參芍口服液對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血脂指標(biāo)和主動(dòng)脈IL-8、VCAM-1和ICAM-1表達(dá)的影響，探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠50只，鼠齡3個(gè)月，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華有限公司提供，清潔級(jí)動(dòng)物，合格證號(hào) SCXK(京):0175819，2010-0038。隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、治療組 (參芍口服液高劑量組、參芍口服液低劑量組、辛伐他汀組)，每組各10只。

1.2 主要試劑 參芍口服液 (藥物組成:丹參250 g，黃芪250 g，赤芍藥150 g，當(dāng)歸150 g，川芎75 g，桃仁125 g，紅花75 g，水蛭187.5 g，地龍250 g，清半夏125 g。河北省唐山市工人醫(yī)院制劑室制備，制劑號(hào):Z20050957，10 mL/支);維生素D3(上海通用藥業(yè)股份有限公司);辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司);IL-8兔抗鼠多克隆一抗 (BA2189，北京博奧森生物技術(shù)有限公司);ICAM-1兔抗鼠多克隆一抗 (bs-1378R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司);VCAM-1兔抗鼠多克隆一抗 (BA0406，武漢博士德生物技術(shù)有限公司);羊抗兔多克隆二抗 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司);羊抗兔IgG-AP、免疫組化SABC試劑盒 (武漢博士德生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 造模方法及分組 SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、治療組 (參芍口服液高劑量組、參芍口服液低劑量組、辛伐他汀組)，每組各10只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組和治療組大鼠給予高脂飲食+維生素D3600000 IU/(kg·d)腹腔注射3 d。4周后，灌胃給藥，參芍口服液高、低劑量組分別按8 mL/d、4 mL/d給藥，辛伐他汀組按5 mg/(kg·d)給藥，其余組給予生理鹽水，給藥8周。

1.4 取材方法 給藥8周后處死，頸總動(dòng)脈取血，ELISA法測(cè)定血清血脂指標(biāo);取完整主動(dòng)脈 (從主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈分叉處)，一部分置4%多聚甲醛中固定，行免疫組化和HE染色;另一部分放入凍存管保存在－80℃冰箱中，用于免疫印跡檢測(cè)，觀察IL-8、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 按試劑盒說明進(jìn)行，IL-8和ICAM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于胞漿。Image pro plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野 (各采集200×圖像)，計(jì)算該樣本的平均積分光密度值 (integral optical density，IOD)。1.6 免疫印跡 取大鼠胸主動(dòng)脈組織100 mg勻漿，按試劑盒說明進(jìn)行。以Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行掃描及平均光密度值 (average optical density，OD)的定量分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 ①正常組動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰。內(nèi)膜為單層扁平狀內(nèi)皮細(xì)胞及其基質(zhì)，內(nèi)膜光滑完整，無增生，厚薄均勻，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，層次清楚而光滑;中膜為長(zhǎng)梭形的平滑肌細(xì)胞，排列整齊，細(xì)胞周圍充滿膠原和彈力纖維組織;外膜較薄，為疏松結(jié)締組織，內(nèi)含少量平滑肌細(xì)胞。②模型組動(dòng)脈管壁三層結(jié)構(gòu)不清晰，內(nèi)膜粗糙，可見大面積增厚、隆起，內(nèi)皮細(xì)胞有缺失，形成斑塊，內(nèi)有泡沫細(xì)胞，深部可見無細(xì)胞的不定型物質(zhì)，其中含有膽固醇結(jié)晶、壞死組織和少量纖維素，在內(nèi)膜下發(fā)現(xiàn)遷移的平滑肌細(xì)胞，其胞漿著色淺，似有脂質(zhì)，中膜平滑肌細(xì)胞仍有增生，排列不規(guī)則，并向內(nèi)膜遷移，病變演化為動(dòng)脈粥樣硬化早期脂質(zhì)條紋。③參芍口服液低劑量組血管內(nèi)膜粗糙，管壁增厚，中膜平滑肌增生，但病變程度較模型組輕。④參芍口服液高劑量組血管內(nèi)膜局部?jī)?nèi)皮粗糙，有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞缺失，平滑肌細(xì)胞增生較少，病理改變明顯好于模型組。⑤辛伐他汀組部分血管內(nèi)皮粗糙，有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞缺失，中膜平滑肌細(xì)胞輕度增生，與參芍口服液高劑量組相似，病理改變明顯好于模型組 (圖1)。

圖1 大鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察及IL-8和ICAM-1蛋白的表達(dá)Fig.1 Aortic pathological observation of rat and IL-8，ICAM-1 protein expression

2.2 TC、TG、LDL-C的變化 模型組TC、TG、 LDL-C顯著高于正常組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。給予參芍口服液和辛伐他汀治療后，TC、TG、LDL-C表達(dá)明顯下調(diào)，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P＜0.05)。高、低劑量組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見表1。

2.3 主動(dòng)脈IL-8、VCAM-1、ICAM-1的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示 (圖2):正常組無 IL-8、ICAM-1的表達(dá)。模型組血管內(nèi)膜IL-8、ICAM-1表達(dá)較高。經(jīng)參芍口服液及辛伐他汀治療后，IL-8、ICAM-1表達(dá)較模型組下降，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。高劑量組較低劑量組下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。和辛伐他汀組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。

表1 參芍口服液對(duì)血脂的影響 (±s，n=10)Tab.1 Effect of Shenshao Oral Liquid on lipids(±s，n=10)

表1 參芍口服液對(duì)血脂的影響 (±s，n=10)Tab.1 Effect of Shenshao Oral Liquid on lipids(±s，n=10)

注:與正常組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05;與低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別TC/(mol·L －1)TG/(mol·L －1)LDL-C/(mol·L －1)正常組1.20±0.09 0.65±0.05 0.71±0.06模型組 18.07±1.02# 0.87±0.04# 10.56±0.53#低劑量組 12.77±0.86* 0.692±0.06* 7.46±0.26*高劑量組 9.40±0.49＊△ 0.38±0.04＊△ 6.83±0.12＊△辛伐他汀組 5.24±0.09* 0.41±0.03* 6.32±0.10*

圖2 主動(dòng)脈中IL-8、VCAM-1和ICAM-1蛋白的表達(dá) (±s)Fig.2 Expressions of IL-8，VCAM-1 and ICAM-1 protein in aorta

免疫印跡結(jié)果顯示 (圖2，圖3):與正常組比較，模型組的IL-8、VCAM-1和ICAM-1表達(dá)條帶增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。經(jīng)參芍口服液及辛伐他汀治療后，IL-8、VCAM-1和ICAM-1蛋白表達(dá)減弱，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P＜0.05)。高劑量組較低劑量組下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，和辛伐他汀組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病。中醫(yī)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化無病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多屬于“胸痹”、“中風(fēng)”、“真心痛”、“頭痛”、“脫疽”等病證范疇［2］。中醫(yī)認(rèn)為，本病是臟腑功能失調(diào)，痰濁蘊(yùn)聚、瘀熱互結(jié)的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制可以概括為痰、瘀、虛、毒的本虛標(biāo)實(shí)之癥［3］。治療上從整體觀念出發(fā)，立足辨證施治，采用活血化瘀、化痰通絡(luò)、益氣補(bǔ)虛等法治療本病，療效肯定、無毒副作用［4］。

圖3 主動(dòng)脈內(nèi)IL-8、ICAM-1蛋白的表達(dá) (免疫印跡)Fig.3 Expression of IL-8，VCAM-1 and ICAM-1 protein(western blot)

課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為本病雖病因眾多，但最終歸結(jié)為“瘀血阻滯，郁結(jié)于血脈”的主要病機(jī)，根據(jù)“久病必瘀”、“久病必虛”的中醫(yī)理論，以“活血化瘀、益氣通絡(luò)”為法而立方參芍口服液。參芍口服液是由補(bǔ)陽(yáng)還五湯加味而來，由丹參、黃芪、當(dāng)歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍、水蛭、清半夏組成。本方重用丹參為君藥，其性苦，微寒，活血化瘀止痛;黃芪大補(bǔ)元?dú)?，使氣旺則血行，當(dāng)歸活血和血，兩藥配合君藥有活中兼養(yǎng)，祛瘀不傷血之妙，是為臣;川芎、赤芍、桃仁、紅花助君增強(qiáng)活血化瘀之效;地龍、水蛭蟲類藥，長(zhǎng)于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò);清半夏辛，溫，化痰散結(jié)，臨床病程遷延，防痰瘀互結(jié)加重病情;以上均為佐藥。綜觀全方，諸藥合用，融活血化瘀，益氣通絡(luò)為一體，以“疏其血，補(bǔ)其氣，經(jīng)通脈順”，諸癥自愈?，F(xiàn)代藥理研究，活血化瘀藥物具有多種生物活性，能增加外周血流量，抑制炎癥、保護(hù)血管內(nèi)皮，抗血栓等作用［5］。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)［6］，炎癥反應(yīng)在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［7］。研究表明，過量IL-8的表達(dá)可引起單核細(xì)胞的趨化，促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間牢固黏附的因子以及平滑肌細(xì)胞增生和遷移，促進(jìn)斑塊形成［8-9］。ICAM-1、VCAM-1在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，能夠調(diào)節(jié)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮上的遷移和黏附，介導(dǎo)循環(huán)血液中外層部分單核細(xì)胞著邊，黏附和遷移，一般很少表達(dá)于正常的冠狀動(dòng)脈血管［10-12］。

本研究結(jié)果顯示，模型組血脂水平增高，IL-8、ICAM-1、VCAM-1高表達(dá)于損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和粥樣硬化斑塊內(nèi)，給予參芍口服液治療后，血脂水平降低，IL-8、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)下降，效果同辛伐他汀治療，提示參芍口服液通過改善血液脂質(zhì)代謝，抑制炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成，與脂質(zhì)浸潤(rùn)、血小板黏附聚集、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮受損、免疫功能失調(diào)、血管平滑肌增殖遷移、氧自由基損傷等多個(gè)作用環(huán)節(jié)有關(guān)［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示參芍口服液多環(huán)節(jié)因素延緩、減輕甚至逆轉(zhuǎn)斑塊的進(jìn)展。從血脂調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)方面探討了中醫(yī)藥治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，為中醫(yī)藥治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化提供了新的思路和線索。

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