陳 斌， 趙伯濤*， 錢 驊， 趙亞南， 陳雙林

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210042;2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210046)

人參花為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey 的花，它在提神［1］、抗氧化［2］、增強(qiáng)免疫力［3］、神經(jīng)保護(hù)［4］、抗癌［5］等諸多方面的保健效果目前已得到世界許多權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)定，被稱為“免疫保健的萬(wàn)能養(yǎng)生品”，人參皂苷是人參花中最重要活性成分，分析其組成與含有量對(duì)開發(fā)利用具有指導(dǎo)作用。

超微粉碎技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種粉碎新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于中藥材的加工，效果顯著。由于超微粉碎使顆粒微細(xì)化導(dǎo)致表面積和孔隙率增加，細(xì)胞破壁，活性成分溶出速率和含有量提高［6］，因而能加強(qiáng)生物活性，提高中藥的生物利用度。本實(shí)驗(yàn)對(duì)超微粉碎后的細(xì)胞形貌特征進(jìn)行觀察并與普通粉碎作對(duì)照，測(cè)定了超微粉和普通粉中總皂苷及單體人參皂苷。

1 材料

1.1 材料與試劑 人參花采自于吉林省長(zhǎng)白縣林業(yè)局參場(chǎng)，經(jīng)南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院龔祝南教授鑒定為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey的花。人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。試劑:4%戊二醛、梯度乙醇、PBS(磷酸緩沖液)。

1.2 儀器與設(shè)備 FW100型高速粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;GQUS—300型氣流粉碎機(jī);JSM—5610LV型掃描電子顯微鏡;752紫外可見分光光度計(jì) (上海菁華科技儀器有限公司);Aglient 1200液相色譜儀、四元泵、DAD檢測(cè)器、Eclipse XDB-C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm);超聲波清洗機(jī) (無(wú)錫雷士超聲波設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參花超微粉與普通粉掃描電鏡觀察 將人參花樣品普通粉碎 (過100目篩)和超微粉碎(過1000目篩)后，用4%的戊二醛固定3 h，用PBS(磷酸緩沖液)洗脫，最后用梯度乙醇脫水，并最終保持在70%乙醇中，常規(guī)臨界點(diǎn)干燥后，用牙簽將少量導(dǎo)電膠涂到樣品臺(tái)上。用鑷子輕夾樣品側(cè)面，保證觀察面向上貼牢在涂膠上。粘貼后，待導(dǎo)電膠干透，真空鍍膜后進(jìn)行SEM鏡檢。

如圖1和圖2分別為普通粉和超微粉于500倍電鏡掃描圖，其中圖1細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整很少有破損，圖2細(xì)胞嚴(yán)重破損幾乎看不到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，圖3和圖4為1500倍下的電鏡掃描圖更加清晰說明普通粉碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而超微粉碎后細(xì)胞幾乎完全破損。圖5和圖6為5000倍下的電鏡掃描圖，圖5細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)清晰可見，而圖6由于細(xì)胞破損嚴(yán)重表面凌亂。

2.2 分光光度法測(cè)定人參花超微粉和普通粉中總皂苷

2.2.1 人參花總皂苷的提取 分別精確稱取人參花普通粉和超微粉各2.5 g，用水飽和的正丁醇溶液75 mL，在80 Hz超聲振蕩條件下，提取3次，每次0.5 h。合并3次提取液，減壓回收正丁醇，殘留物加甲醇溶解，最后定容至5 mL，得到0.5 g/mL人參花超聲提取液。

圖1 普通粉碎500x電鏡掃描圖Fig.1 The scanning image of ordinary powder at 500x electric mirror

圖2 超微粉碎500x電鏡掃描圖Fig.2 The scanning image of ultrafine powder at 500x electric mirror

圖3 普通粉碎1500x電鏡掃描圖Fig.3 The scanning image of ordinary powder at 1500x electric mirror

圖4 超微粉碎1500x電鏡掃描圖Fig.4 The scanning image of ultrafine powder at 1500x electric mirror

圖5 普通粉碎5000x電鏡掃描圖Fig.5 The scanning image of ordinary powder at 5000x electric mirror

圖6 超微粉碎5000x電鏡掃描圖Fig.6 The scanning image of ultrafine powder at 5000x electric mirror

2.2.2 確定最大吸收波長(zhǎng) 精密量取0.5 g/mL的普通粉和超微粉超聲提取液各1 mL，用蒸餾水稀釋至10 mL，得到0.05 g/mL的人參花提取液。分別精密量取0.05 g/mL的普通粉和超微粉提取液各50 μL，在60℃水浴中蒸發(fā)至干。加5%香草醛-冰醋酸溶液 (臨用新配)0.2 mL，高氯酸0.8 mL，密塞于60℃水浴顯色15 min后置冰浴中冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻立即在400～700 nm波長(zhǎng)下掃描，空白溶液作參比，確定最大吸收波長(zhǎng)為538 nm。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取人參皂苷Re 5 mg，溶于10 mL量瓶中，制得0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取 50、60、70、80、90、100 μL，按上述方法顯色后于538 nm處測(cè)定吸光值，得線性方程為y=0.0024x－0.0956，R2=0.0993，線性范圍在12 ～118 μg。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.5 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品溶液60 μL 5份，按2.2.2項(xiàng)中的顯色方法顯色后測(cè)定吸收度，結(jié)果RSD為0.97%。

2.2.5 樣品溶液穩(wěn)定性和顯色后溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取普通粉和超微粉樣品溶液放置，分別在0、1、2、3、4 h取樣60 uL，平行取3管，按照線性實(shí)驗(yàn)方法顯色后測(cè)定吸收度，計(jì)算，結(jié)果4 h內(nèi)普通粉和超微粉都很穩(wěn)定，RSD分別為1.17%和1.34% 。取普通粉和超微粉樣品各60 μL，平行取三管，顯色后放置，分別在0、1、2、3 h測(cè)定吸收度，計(jì)算，結(jié)果3 h內(nèi)較穩(wěn)定，RSD為2.27%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取普通粉和超微粉樣品溶液顯色后，6次獨(dú)立測(cè)定吸光度，結(jié)果普通粉中含總皂苷量為10.71%，RSD為1.56%，超微粉中含總皂苷量為13.97%，RSD為1.32%。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含總皂苷量的普通粉和超微粉各3份，分別加入一定量Re對(duì)照品，超聲提取定容后各取60μL樣品液，顯色后測(cè)定吸收度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1 Recovery experiment

2.2.8 定量測(cè)定 稱量普通粉和超微粉樣品，按2.2.1項(xiàng)中的方法提取并定容，顯色后6次獨(dú)立測(cè)定吸光度，結(jié)果見表2。

表2 普通粉和超微粉中含總皂苷量(n=6)Tab.2 Content of total saponin in ordinary and ultrafine powder(n=6)

2.3 HPLC法測(cè)定人參花中人參皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別稱取一定量的人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd對(duì)照品用甲醇溶于同一10 mL量瓶中制成混合對(duì)照品溶液用微孔濾膜過濾 (0.22 μm)。色譜條件:流動(dòng)相為乙腈 (A)和水 (B)，梯度洗脫 (0～35 min，A為18.5%;35～55 min，A由18.5%升至29%;55～70 min，A由29%升至40%;70～80 min，A為40%)，柱溫為20℃，于203 nm處測(cè)定峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］。圖 7 依次為人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd混合對(duì)照品溶液 (A)、普通粉碎人參花 (B)和超微粉碎人參花 (C)的HPLC圖譜，表3為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7 人參皂苷混合對(duì)照品 (A)，普通粉 (B)及超微粉 (C)的HPLC圖譜Fig.7 HPLC chromatograms of mixed reference substences(A)，ordinary powder(B)and ultrafine powder(C)

表 3 人參皂苷(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.3 The standard curves of ginsenoside(Rg1，Re，Rb1，Rc，Rd)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 將2.3.1中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對(duì)照品溶液分別等量進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，其 RSD分別為0.96%、0.33%、0.85%、0.73%、0.48%。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 平行5次測(cè)定普通粉和超微粉中單體人參皂苷，結(jié)果見表4。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知各單體皂苷含有量的普通粉和超微粉各3份，分別加入一定量含5種皂苷的混合標(biāo)準(zhǔn)品超聲提取后定容，采用2.3.1中的色譜條件并于203 nm處測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出各單體人參皂苷的含量計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.4 Results of reproducible experiment(n=5)

表5 普通粉和超微粉中各單體人參皂苷的加樣回收率試驗(yàn)(n=3)Tab.5 Recovery experiment of each ginsenoside in ultrafine and ordinary powder(n=3)

2.3.5 定量測(cè)定 另取普通粉和超微粉超聲提取后定容，采用2.3.1項(xiàng)中的色譜條件梯度洗脫并于203 nm處測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出各單體人參皂苷的含有量，平行測(cè)定5次比較普通和超微粉碎人參花中各單體人參皂苷溶出率，結(jié)果見表6。

表6 超微粉和普通粉中各人參皂苷的含有量(±s，n=5)Tab.6 Contents of each ginsenoside in ultrafine and ordinary powder(±s，n=5)

表6 超微粉和普通粉中各人參皂苷的含有量(±s，n=5)Tab.6 Contents of each ginsenoside in ultrafine and ordinary powder(±s，n=5)

人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g－1)Rc Rd超微粉 9.11±0.38 59.73±0.47 11.52±0.53 12.87±0.14 Rg1 Re Rb1 27.45±0.25普通粉 6.37±0.29 44.79±0.41 8.20±0.39 9.38±0.45 19.48±0.18

3 討論

人參花掃描電鏡顯示普通粉碎人參花被分散成很多組織塊，在提取的過程中細(xì)胞中的人參皂苷需透過多層細(xì)胞膜才能到達(dá)細(xì)胞外，且由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的存在滲透平衡始終存在，很難將細(xì)胞中的人參皂苷完全提取出來。而超微粉碎后的人參花不存在多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破裂，人參皂苷無(wú)需透過細(xì)胞膜便可溶解在提取溶劑中。分別對(duì)普通粉及超微粉進(jìn)行總皂苷及人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd的測(cè)定，結(jié)果與普通粉相比超微粉總皂苷的溶出率提高約 30%，而人參皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rc、Rd的溶出率也顯著的提高。

人參中的主要活性成分為人參皂苷，《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定人參中人參皂苷Rg1、Re含有量不得低于0.3%，Rb1不得低于0.2%，而人參花尤其經(jīng)超微粉碎后的人參花這3種皂苷的含有量是上述標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)倍乃至數(shù)十倍，并且其中Re、Rd的含有量較高且各種皂苷的組成和比例與人參中的差異較大。以人參皂苷Re為例超微粉碎后的人參花約為人參中的10倍，而Re已確認(rèn)對(duì)二型糖尿病及其并發(fā)癥有顯著作用，Re可以降低二型糖尿病小鼠的空腹血糖，提高其糖代謝的能力并可以降低小鼠眼球、腎及主動(dòng)脈細(xì)胞中MDA的水平同時(shí)還原型谷胱甘肽的水平有明顯提高［8］。可以明顯降低糖尿病小鼠血漿中C－反應(yīng)蛋白的水平，對(duì)糖尿病小鼠有一定的抗炎作用，可以緩解糖尿病后期的并發(fā)癥［9］。此外，Rb1能促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝?。?0］，Rc能促進(jìn)肌肉細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝?。?1］，Rc已證明對(duì)心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等作用獨(dú)特，在鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護(hù)等作用方面其作用也要大于其他人參皂苷［12］。因此，超微粉碎后的人參花可能在糖尿病、神經(jīng)性疾病等藥物或保健產(chǎn)品的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。

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