王 芳， 計(jì)巧靈， 鄧 倩， 李玉薇

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

羅布麻Apocynum venetum Linn隸屬夾竹桃科Apocynaceae羅布麻屬，是一種多年生草本植物，又名野麻、紅麻、茶葉花，我國(guó)主要分布在新疆、青海、甘肅、陜西、河南等省區(qū)［1］。羅布麻全草入藥已千年，分別被載入2005、2010年版的《中國(guó)藥典》之中［2-3］。羅布麻葉含有黃酮類(lèi)化合物、生物堿、酚類(lèi)、強(qiáng)心苷、氨基酸和微量元素［4-5］，其中黃酮類(lèi)化合物在羅布麻的藥用成分中占很大比例［6］，主要包括蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等［7-8］，據(jù)報(bào)道，金絲桃苷、異槲皮苷在鎮(zhèn)痛、保護(hù)心肌、保肝、抗氧化方面有重要作用［9-12］。然而，由于羅布麻生境、氣候環(huán)境等條件不斷惡化，致使資源越來(lái)越匱乏，不宜大規(guī)模開(kāi)發(fā)利用，限制了羅布麻這一重要資源的開(kāi)發(fā)。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，研究以羅布麻愈傷組織為材，生產(chǎn)金絲桃苷、異槲皮苷等重要的次生代謝藥效成分具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，關(guān)于運(yùn)用羅布麻組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分的研究，除了本實(shí)驗(yàn)室以羅布麻愈傷組織為材產(chǎn)綠原酸［13］外，在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)其他報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討了培養(yǎng)條件對(duì)羅布麻愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷積累的影響，以期為提高羅布麻愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷的含有量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-10A高效液相色譜儀 (日本島津公司)(LC-10ATVP泵，SPD-10AVP紫外檢測(cè)器，CTO-10AVP柱溫箱，2010化學(xué)工作站);0.22 μm微孔纖維素濾膜;KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器;SORVALL Pico and Fresco微型離心機(jī);電子天平 (型號(hào) AL104，METTLER TOLEDO);PYX-DHS-40X50-B型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備。金絲桃苷對(duì)照品 (批號(hào):20110311)，異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào):20110619)均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;甲醇 (色譜純);乙腈 (色譜純);磷酸(優(yōu)級(jí)純);超純水。

1.2 材料 羅布麻種子采自新疆精河縣，羅布麻子葉來(lái)源的愈傷組織由本實(shí)驗(yàn)室提供，愈傷組織培養(yǎng)溫度為 (25±2)℃，光照周期為16 h/d，光強(qiáng)度為2500 lx。愈傷組織分別培養(yǎng)在不同條件的培養(yǎng)基，收集的愈傷組織在培養(yǎng)箱中30℃干燥至恒定質(zhì)量，粉碎過(guò)40目篩，得粗粉備用。

1.3 色譜條件 C18-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm);柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm;體積流量0.6 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相Tab.1 Mobile-phase of gradient elution

1.4 愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的測(cè)定

1.4.1 愈傷組織生長(zhǎng)率的測(cè)定 每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接種愈傷組織5塊 (約0.5 g)，愈傷組織生長(zhǎng)25 d后，取出每瓶中的愈傷組織稱(chēng)定質(zhì)量。愈傷組織生長(zhǎng)率=(收獲時(shí)的愈傷組織濕重-接種時(shí)的愈傷組織濕重)/接種量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 金絲桃苷和異槲皮苷的測(cè)定 精確稱(chēng)取粗粉0.10 g，準(zhǔn)確加入80% 甲醇1.0 mL，于40℃，60 W，超聲提取40 min，12000 r/min離心5 min，取上清，過(guò)0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定金絲桃苷和異槲皮苷。

1.5 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品各20 mg，分別加80%甲醇100 mL溶解，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.6 線性關(guān)系考察 分別取上述金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品溶液 0.5、2.5、5、7.5、10 mL，用80%甲醇定容至10 mL，按照上述色譜條件取20 μL進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以峰面積與質(zhì)量濃度 (x)繪制工作曲線，得金絲桃苷回歸方程為y=752.76x－2.6927，R2=0.9996;異槲皮苷回歸方程為y=728.32x－2.58297，R2=0.9998，結(jié)果在0.01～0.20 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.7 羅布麻葉中金絲桃苷和異槲皮苷

1.7.1 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取上述兩種對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算，得金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.4%、1.2%，表明精密度良好。

1.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品，分別于0、1、2、4、8、12、14、16 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算，得金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.0%、0.9%，表明樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)供試品共5份，按1.4.2項(xiàng)制備，測(cè)定，金絲桃苷、異槲皮苷的峰面積的平均值分別為4091366.2、6163213.1，RSD分別為1.1%、1.3%，表明重復(fù)性良好。

1.7.4 加樣回收試驗(yàn) 取同一個(gè)樣品共12份，其中6份用于測(cè)定本底值，另外6份中分別添加一定量的金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果金絲桃苷平均回收率98.34%，RSD為1.6%;異槲皮苷平均回收率97.58%，RSD為1.3%，說(shuō)明該方法適合分析羅布麻愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷。

1.7.5 樣品測(cè)定 精確稱(chēng)取羅布麻葉粉0.1 g，按1.4.2項(xiàng)提取，經(jīng)HPLC檢測(cè)，8月份野生羅布麻葉中金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.02 mg/g、7.14 mg/g。

1.8 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.8.1 測(cè)定8月份野生羅布麻葉片中金絲桃苷和異槲皮苷，操作同1.7.5項(xiàng)。

1.8.2 將多份相近質(zhì)量的愈傷組織分別接種在含不同激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討愈傷組織產(chǎn)金絲桃苷、異槲皮苷的最佳激素配比 (見(jiàn)表2)。

表2 培養(yǎng)基不同激素配比對(duì)愈傷組織產(chǎn)金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.2 Effects of media with the different matching of hormone on hyperinand and isoquercitrin contents in callus of Apocynum venetum L.*

1.8.3 將稱(chēng)定質(zhì)量的多份愈傷組織分別接種在含不同蔗糖、葡萄糖濃度的最佳激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 (見(jiàn)表3)。

1.8.4 將稱(chēng)定質(zhì)量的多份愈傷組織分別接種在含不同濃度的NH4NO3和KNO3、而含最佳碳源、激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討氮源對(duì)愈傷組 織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 (見(jiàn)表4)。

表3 碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.3 Effects of carbon source on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

表4 氮源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.4 Effects of nitrogen source on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

1.8.5 將稱(chēng)重的多份愈傷組織分別接種在添加不同濃度NaCl而含最佳氮源、碳源、激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討NaCl濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 (見(jiàn)表5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)羅布麻愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷積累的影響 由表2可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基附加0.5 mg/L KT和0.5 mg/L NAA時(shí)，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量均最高，分別達(dá)到6.12 mg/g和7.23 mg/g;在4種激素組合中，KT和NAA組合最有利于愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷的積累;適量濃度的KT與NAA，6-BA與NAA組合較有利于愈傷組織生長(zhǎng)。

2.2 培養(yǎng)基碳源對(duì)羅布麻愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 由表3可知，培養(yǎng)基的碳源為20g/L蔗糖+20g/L葡糖糖時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷含有量均達(dá)最高，分別為14.89倍和7.45 mg/g、8.69 mg/g;培養(yǎng)基以蔗糖為碳源較有利于愈傷組織的生長(zhǎng);培養(yǎng)基不同碳源對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷積累有較大影響。

表5 不同濃度NaCl對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.5 Effects of different NaCl concentrations on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

2.3 培養(yǎng)基氮源對(duì)羅布麻愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 由表4可知，當(dāng)培養(yǎng)基含1650 mg/L NH4NO3+1900 mg/L KNO3時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)率最大，為13.74倍，金絲桃苷和異槲皮苷含有量分別達(dá)到7.71 mg/g和8.99 mg/g;當(dāng)培養(yǎng)基中含2475 mg/L NH4NO3+2850 mg/L KNO3或3300 mg/L NH4NO3+3800 mg/L KNO3時(shí)，愈傷組織褐化嚴(yán)重，部分死亡;當(dāng)培養(yǎng)基含2475 mg/L NH4NO3時(shí)，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量均達(dá)最大值，分別為8.67 mg/g、9.86 mg/g，生長(zhǎng)率為7.95倍，可見(jiàn)氮源對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的積累有較大影響。

2.4 不同濃度NaCl對(duì)羅布麻愈傷組織生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 由表5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為25 mmol/L時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)率最大，為13.36倍;隨著NaCl濃度增加，生長(zhǎng)率逐漸減小，當(dāng)NaCl濃度為500 mmol/L時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐化，部分死亡。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量最高，分別為10.07 mg/g、11.15 mg/g;當(dāng)NaCl濃度為300 mmol/L時(shí)，這兩種成分的含有量分別為8.09 mg/g、9.17 mg/g，可見(jiàn)，適量濃度NaCl能促進(jìn)愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷的積累。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中添加不同激素配比對(duì)細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的積累有一定影響，這與文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道的一致，培養(yǎng)基中添加不同配比的激素，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量不同，附加0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA時(shí)，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量最高，說(shuō)明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響植物次生代謝物質(zhì)積累的一個(gè)因素。

糖是培養(yǎng)基必需的碳源，既提供能量，也對(duì)維持滲透壓起重要作用，通過(guò)探究不同碳源對(duì)愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量的影響，發(fā)現(xiàn)碳源為2.0 mg/L蔗糖+2.0 mg/L葡糖糖時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)率和金絲桃苷、異槲皮苷含有量均達(dá)最高，但碳源為5.0 mg/L時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝物積累均受到抑制，可能是糖濃度過(guò)高，致使培養(yǎng)基滲透壓提高，不利于細(xì)胞被動(dòng)吸收營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而影響愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝物積累。

氮源也是培養(yǎng)基中不可缺少的養(yǎng)分，氮元素含有量的減少往往刺激次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量增加［16］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中氮源單獨(dú)使用NH4NO3或KNO3時(shí)，濃度過(guò)高、過(guò)低均不利于愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷的積累;同時(shí)使用兩種氮源時(shí)，較單獨(dú)使用利于金絲桃苷和異槲皮苷的積累，但是濃度過(guò)高會(huì)使細(xì)胞褐化死亡;培養(yǎng)基添加常規(guī)MS培養(yǎng)基氮源時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)率最大;若僅考慮金絲桃苷和異槲皮苷的含有量，2475 mg/L NH4NO3為最佳氮源。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中NaCl濃度為25 mmol/L時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)率最大，培養(yǎng)基中NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含量最高，但是當(dāng)NaCl為500 mmol/L時(shí)，愈傷組織褐化死亡;說(shuō)明NaCl對(duì)愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的積累起一定的作用，可能是因?yàn)榱_布麻是一種耐鹽植物，其細(xì)胞對(duì)一定濃度的鹽離子有耐受性。有關(guān)培養(yǎng)基中NaCl對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

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