西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（西安710003） 董亞茹 由鳳秋 楊 震

缺血后神經(jīng)保護(hù)劑的應(yīng)用，已在腦缺血損傷治療上起到了重要的作用。聯(lián)合治療因其能應(yīng)用不同神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)缺血再灌注損傷后引起的瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)的不同路徑起到阻止或延緩作用，而有很好的應(yīng)用前景。我們通過對(duì)聯(lián)合應(yīng)用硫酸鎂及胞二磷膽堿治療全腦缺血再灌注大鼠的研究，觀察缺血再灌注后大鼠神經(jīng)行為及海馬神經(jīng)元Bcl－2表達(dá)的變化，探討其治療效果。

材料及方法

1 材 料 兔抗鼠Bcl－2抗體及SABC免疫試劑盒；SD大鼠，280～320g，雄性，60只（西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。隨機(jī)分為：缺血組、硫酸鎂組、胞二磷組、聯(lián)合組，每組又分為1、3、7日組。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。另外選2只大鼠不進(jìn)行模型制作，作為正常對(duì)照組。

2 方 法 ①模型制作：采用改良的四血管阻塞法［1］制成大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350 mg/kg體重）腹腔注射后，俯位固定于立體定位儀上，頭向下屈曲30度暴露錐間隙后，于頸后第一、二頸椎處，切一長約2c m切口，分離頸部的肌肉，暴露第一頸椎上的雙側(cè)翼孔，插入雙極電凝器，燒凝其中走行的椎動(dòng)脈，清潔、縫合傷口，置籠喂養(yǎng)。禁食，自由飲水。24h后同法麻醉動(dòng)物，仰臥位固定后分離頸部肌肉，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉30 min后實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)翼孔及頸總動(dòng)脈，各血管不行閉塞。觀察各組大鼠的意識(shí)、瞳孔、角膜反射、翻正反射等變化，并做記錄。模型成功標(biāo)準(zhǔn)［2］：雙側(cè)頸動(dòng)脈夾閉后1 min內(nèi)動(dòng)物意識(shí)喪失；眼球變白，雙側(cè)瞳孔散大，對(duì)光反射消失；翻正反射消失。不符和上述標(biāo)準(zhǔn)者或再灌流期間出現(xiàn)全身強(qiáng)直、抽搐等異常發(fā)應(yīng)者排除實(shí)驗(yàn)。②治療方案：缺血結(jié)束后再灌注開始時(shí)即用藥，硫酸鎂組：硫酸鎂90 mg/kg腹腔注射；胞二磷膽堿組：胞二磷膽堿250 mg/kg腹腔注射；聯(lián)合組：硫酸鎂、胞二磷膽堿同上劑量腹腔注射，正常對(duì)照組及缺血組腹腔內(nèi)注射生理鹽水1．5 ml，依次于同時(shí)間連續(xù)注射1、3、7日。③取材及制作標(biāo)本：依各時(shí)間段在麻醉狀態(tài)下開胸經(jīng)左心室至主動(dòng)脈插管，先用溫?zé)嵘睇}水快速灌注300 ml左右，再以4%多聚甲醛灌注前固定，先快后慢，在開始的5 min灌注約200 ml，再根據(jù)動(dòng)物肢體變硬狀況調(diào)整流速，使總灌注時(shí)間保證在30 min左右，然后斷頭取腦，于乳頭體及視交叉平面行冠狀切開，制成包含背側(cè)海馬的約4 mm厚的腦片，后固定48h后常規(guī)石蠟包埋、切片（厚約5μm）干燥。④HE染色：切片脫蠟至水蘇木素染5～10 min，鹽酸酒精分色后伊紅染3～5 min，脫水后封片、觀察。⑤Bcl－2免疫組化染色：干燥切片脫蠟至水，置入枸櫞酸鈉緩沖液（p H6．0）行微波抗原修復(fù)10 min，沖洗后滴加30g/L H2O2阻斷內(nèi)源性酶15 min，沖洗5 min，分別滴加Bcl－2抗體10μl，4℃孵育過夜，PBS沖洗后，參照SABC試劑盒說明分別滴加二抗及SABC、DAB顯色液，脫水后封片、觀察。⑥神經(jīng)行為功能的觀察：利用美國弗尼吉亞大學(xué)顱腦損傷研究中心提供的評(píng)分方法檢測(cè)［3］。各組動(dòng)物均在手術(shù)前3d進(jìn)行行走訓(xùn)練，并于缺血前1h測(cè)定其基礎(chǔ)值，缺血后連續(xù)測(cè)定，每組動(dòng)物分別測(cè)兩次。行走實(shí)驗(yàn)：觀察大鼠在寬2．5c m，長30c m的木條上行走情況，記錄通過所需時(shí)間。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組均數(shù)的方差分析和t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 HE染色 光鏡下，正常海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，排列整齊，核圓形，核仁清晰。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞散在，細(xì)胞體積縮小，核固縮，染色質(zhì)濃染或邊聚。硫酸鎂組、胞二磷膽堿組及聯(lián)合組與缺血組比較凋亡細(xì)胞減少，其中聯(lián)合組較其他組凋亡細(xì)胞明顯減少。

2 Bcl－2蛋白染色 Bcl－2蛋白染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)染色棕黃色，顆粒狀分布，胞核不著色，細(xì)胞體積正常。正常海馬區(qū)未見染色陽性細(xì)胞。缺血再灌注24h，Bcl－2明顯表達(dá)，硫酸鎂組、胞二磷膽堿組及聯(lián)合組與缺血組相比較明顯增加（P＜0．05）。缺血再灌注3d時(shí)陽性細(xì)胞較多，其中聯(lián)合組與其他組相比陽性細(xì)胞數(shù)目有明顯差異（P＜0．05）。缺血再灌注7d后陽性細(xì)胞逐漸減少，但聯(lián)合組陽性細(xì)胞與其他組比較仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。見表1。

表1 缺血再灌注后1、3、7d各組Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)比較（，個(gè)/每視野）

表1 缺血再灌注后1、3、7d各組Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)比較（，個(gè)/每視野）

注：與缺血組相比較＊P＜0．05，△P＜0．01

組 別 1d 3d 7d缺血組 12．0±1．4 9．8±1．9 6．3±1．4胞二磷膽堿組 13．5±1．5＊ 12．0±2．4＊ 9．0±1．9＊硫酸鎂組 18．0±1．7＊ 14．9±1．3＊ 10．0±2．0＊聯(lián)合組 25．1±1．6＊△ 21．3±1．8＊△ 16．9±1．6＊△

3 神經(jīng)行為功能觀察 缺血組行走實(shí)驗(yàn)明顯遲緩于其他組（P＜0．01），聯(lián)合組肢體恢復(fù)與單一用藥組比較有明顯差異（P＜0．01），硫酸鎂組與胞二磷膽堿組比較無明顯差異。見表2。

表2 缺血再灌注后1、3、7d各組行走功能比較（，s/個(gè)）

表2 缺血再灌注后1、3、7d各組行走功能比較（，s/個(gè)）

注：與缺血組比較＊P＜0．05，△P＜0．01

組 別 缺血前 再灌注后1d 再灌注后3d 再灌注后7d缺血組 3．67±0．79 20．00±2．10 23．90±1．58 28．20±0．75胞二磷膽堿組 3．60±1．02 7．20±1．72＊ 8．20±1．33＊ 10．20±2．14＊硫酸鎂組 3．67±1．01 6．80±1．33＊ 7．60±1．02＊ 9．20±1．33＊聯(lián)合組 3．60±1．08 5．40±1．02＊△ 6．40±1．02＊△ 8．40±1．50＊△

討 論

研究［4］證實(shí)，細(xì)胞凋亡是腦缺血過程中神經(jīng)元損失的一種形式。細(xì)胞凋亡是通過合成某些新的蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的，而Bcl－2家族蛋白的調(diào)控是其中之一重要機(jī)制。研究顯示，低水平的Bcl－2 mRNA廣泛分布于發(fā)育中和成熟的大鼠腦中，Bcl－2基礎(chǔ)表達(dá)減少則易導(dǎo)致某些細(xì)胞死亡。Bcl－2是重要的抑制神經(jīng)元的凋亡的蛋白，在缺血后注定要存活的神經(jīng)元中表達(dá)。也有研究表明，腦缺血再灌注后24h海馬區(qū)的Bcl－2蛋白表達(dá)才明顯上升，啟動(dòng)相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組大鼠凋亡神經(jīng)元數(shù)目與其他組相比明顯減少，說明聯(lián)合應(yīng)用硫酸鎂及胞二磷膽堿抑制缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損，對(duì)缺血損傷有明顯的治療作用。

硫酸鎂的神經(jīng)保護(hù)作用的研究主要為局灶性腦缺血的預(yù)防及治療方面［5－6］。鎂離子能夠阻斷由鈣超載引起的細(xì)胞損傷途徑，從而保護(hù)細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能、降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫、縮小梗死體積［7－8］。本研究表明給予不同周期硫酸鎂均可有效減輕腦神經(jīng)細(xì)胞病理損害、增加Bcl－2蛋白表達(dá)，并促進(jìn)大鼠行為功能恢復(fù)。胞二磷膽堿參與體內(nèi)磷脂酰膽堿的合成，有改善腦代謝作用，并可減輕腦水腫，刺激神經(jīng)生長，還可恢復(fù)腦缺血后損害的膜結(jié)構(gòu)的完整性。研究［9］認(rèn)為胞二磷膽堿的腦保護(hù)作用與抑制腦缺血誘導(dǎo)的谷氨酸濃度升高、阻止缺血所致ATP水平下降、穩(wěn)定細(xì)胞膜、抑制自由脂肪酸的釋放和減少自由基的產(chǎn)生有關(guān)。本研究表明其與缺血組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與硫酸鎂組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而聯(lián)合組與其他各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明聯(lián)合治療可優(yōu)于各單一藥物治療，能更顯著改善腦神經(jīng)功能恢復(fù)。

腦缺血缺氧的聯(lián)合治療目的是獲得完全的功能恢復(fù)及組織學(xué)正常的大腦。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，除了具有多種治療效應(yīng)的鈣離子通道阻滯劑有輕度益處外，各種單一的藥物治療均不能對(duì)神經(jīng)功能預(yù)后產(chǎn)生良好的效應(yīng)。因此，需要對(duì)進(jìn)一步聯(lián)合治療進(jìn)行積極評(píng)價(jià)。細(xì)胞膜穩(wěn)定劑胞二磷膽堿及NMDA拮抗劑鎂的聯(lián)合使用可作用于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的不同方面，并減少藥物劑量，降低不良反應(yīng)發(fā)生率，對(duì)缺血腦組織將有明顯的保護(hù)作用。

［1］Pulsinelli WA，Brierley B．A new modle of bilateral he mispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］．Stroke，1979，10：267．

［2］Zhang L，Hsu JU，Takagi NO，et al．Transient global ischemia alters NMDA receptor expression in rat hippocampus，correlation with decreased i mmunoreactive prote in levels of the NR2 A/2B subunits，and an altered NMDA receptor functionality［J］．J Neurochem，1997，69（5）：1983－1993．

［3］Siesjo BK．Pathophysiology and treat ment of focal cerebralis－chemia．PartⅡ：Mechanis ms of damage and treatment［J］．J Neur osur g，1992，77（3）：337－342．

［4］Namura S，Zhu J，F(xiàn)ink K，et al．Activation and cleavage of Caspase 3 in apopt psis induced by experi mental cerebral ischemia［J］．J Neurisci，1998，18：3659－3664．

［5］歐冊(cè)華，姜 鮮，張 毅，等．鎂對(duì)兔全腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（21）：4167－4173．

［6］盛寶英，任 瑛，姚海濤，等．不同劑量硫酸鎂對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2004，21（2）：174－175．

［7］del Zoppo GJ．Stroke and neurovascular pr octection［J］．N Engl J Med，2006，354（3）：553－555．

［8］陳 萍，陳立云，王擁軍．缺血性卒中的神經(jīng)血管單元保護(hù)研究進(jìn)展［J］．中國卒中雜志，2007，2（12）：1003－1007．

［9］Hurtado O，Moro MA，Car denas A，et al．Neuroprotection afforded by prior citicoline ad ministration in experi mental brain ischemia：effects on gluta mate transport［J］．Neur obiol Dis，2005，18：336－345．