李海梅，馬 鶯，崔艷華，汪加琦，李啟明，何勝華

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090 哈爾濱;2.新希望乳業(yè)有限公司研究開發(fā)中心，610041 成都）

牦牛乳中主要過敏原的分離純化

李海梅1，馬 鶯1，崔艷華1，汪加琦2，李啟明2，何勝華1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090 哈爾濱;2.新希望乳業(yè)有限公司研究開發(fā)中心，610041 成都）

為研究牦牛乳蛋白質(zhì)的過敏性，用化學(xué)方法分離牦牛乳中主要的過敏原蛋白質(zhì)，采用快速蛋白純化系統(tǒng)(FPLC)結(jié)合凝膠層析技術(shù)對分離出的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化.在牦牛脫脂乳中添加10%醋酸至酪蛋白的等電點(diǎn)pH4.6，使酪蛋白和乳清蛋白分離.根據(jù)酪蛋白在尿素溶液中的溶解度和對鈣的敏感性不同，對酪蛋白進(jìn)行粗分級，得到αs-酪蛋白和β-酪蛋白.應(yīng)用離子交換色譜和葡聚凝膠sephadex G100進(jìn)一步純化粗分級得到的酪蛋白，得到αs-casein和β-酪蛋白.以檸檬酸鈉為螯合劑、在低pH并有鹽存在的條件下從酸乳清中分離出β-乳球蛋白，F(xiàn)PLC純化后用RP-HPLC檢測其純度，得到αs-casein和β-酪蛋白純度分別為87.13%和88.58%，β-乳球蛋白的純度為80.00%.

牦牛乳;酪蛋白分離;β-乳球蛋白分離;快速蛋白純化色譜

牛乳中主要的過敏原蛋白為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和β-乳球蛋白［1］.牦牛乳蛋白質(zhì)組成與牛乳相似［2］，哺乳動物又具有交叉免疫原性，因此，牦牛乳中的過敏原蛋白質(zhì)可能與牛乳中的相似.為了更好地研究牦牛乳的過敏機(jī)制，對牦牛乳中主要過敏原蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化是非常必要的.

目前能有效分離乳中αs-酪蛋白、β-酪蛋白的方法很多，如反相高效液相色譜(RP-HPLC)、毛細(xì)管電泳、疏水層析等，β-乳球蛋白的分離方法也很多，如鹽析、等電點(diǎn)沉淀、三氯乙酸沉淀、離子交換層析、疏水層析等［1，3－5］.但這些方法都不能分離出足夠多的目的蛋白用于過敏原的分析［6－9］，或成本高、工藝復(fù)雜.蛋白質(zhì)快速分離純化系統(tǒng)(FPLC)是20世紀(jì)中期開始應(yīng)用的一種大量分離蛋白質(zhì)的技術(shù)［10－12］，它既可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的快速分離，又可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行富集.化學(xué)分離結(jié)合FPLC方法能更有效地分離并純化乳中的蛋白質(zhì).因此，本實驗應(yīng)用化學(xué)分離結(jié)合FPLC陰離子交換層析和葡聚糖凝膠Sephadex G100層析來分離純化和富集牦牛乳酪蛋白.

1 實驗

1.1 材料與試劑

Cellulose DE-52(Whatman);N，N'-甲叉雙丙烯酰胺(Merck公司);乙腈(色譜純)，上海國大化工有限公司;丙烯酰胺，Sigma公司;Sephadex G100，Sigma公司;其他所用試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

層析柱(Φ1.6 cm×15 cm)，上海錦華層析設(shè)備廠;FPLC蛋白純化儀，AKTAprime;垂直板電泳槽(儀)，上海六一儀器有限公司;HPLC色譜儀，Agilent.

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

于2009年5月在四川省麥洼地區(qū)采集牦牛乳樣品，用滅菌瓶(500 mL/瓶)封裝，樣品速凍后空運(yùn)回實驗室.從四川到哈爾濱的運(yùn)輸過程中樣品一直處于冷凍狀態(tài)，回實驗室后放于－20℃冰柜保存，測定時流水解凍.

1.3.2 牦牛乳酪蛋白和乳清蛋白的分離

采用等電點(diǎn)沉淀的方法分離牦牛乳酪蛋白和乳清蛋白.牦牛乳500 mL在2 500×g，20℃條件下離心30 min，去除上層脂肪后得牦牛脫脂乳.10%醋酸調(diào)脫脂乳的pH為4.6，室溫靜置30 min后，混合液在500×g條件下離心20 min，得沉淀為酪蛋白，上清液為乳清蛋白.乳清蛋白于－20℃保存?zhèn)溆?酪蛋白用蒸餾水洗3次后再分散到蒸餾水中，并用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH7.0，酪蛋白溶解后再用10%醋酸調(diào)pH為4.6，重新沉淀酪蛋白.此步驟重復(fù)3次后，酪蛋白于－20℃保存?zhèn)溆?

1.3.3 化學(xué)方法分離牦牛乳酪蛋白和乳清蛋白

1)α-酪蛋白和β-酪蛋白的分離.酪蛋白在不同濃度尿素溶液中的溶解度不同，本實驗將全酪蛋白15 g溶于6.6 mol/L尿素中，再將溶液稀釋到尿素的終濃度為4.6 mol/L，4 000 r/min條件下離心15 min，得α-酪蛋白沉淀.上清液稀釋到尿素終濃度為 1.7 mol/L，并調(diào)節(jié) pH為 4.7，4 000 r/min離心 15 min，得 β-酪蛋白沉淀［1］.

2)牦牛乳β-乳球蛋白(β-Lg)的分離.采用鹽析的方法制備 β-Lg［4］.在乳清蛋白中加 NaC(檸檬酸鈉)，并調(diào)節(jié) NaC濃度為 0.15 mol/L，用6 mol/L檸檬酸調(diào) pH3.9，35℃恒溫45 min后，5 000×g、4℃條件下低溫離心30 min.得到的上清液用7%NaCl溶液清洗2次，在10 000×g、4℃條件下低溫離心20 min.沉淀廢棄，上清液4℃透析24 h后，－40℃凍干48 h，得β-Lg.

1.3.4 牦牛乳酪蛋白和乳清蛋白的FPLC Cellulose DE-52層析純化

蛋白質(zhì)快速純化系統(tǒng)(FPLC)包括AKTA exporer Air 100、填充 20 mL Cellulose DE-52(Pharmacia)介質(zhì)的層析柱(Φ1.6 cm×15 cm)，紫外檢測波長λ=280 nm.緩沖液A為pH7.0的咪唑-鹽酸緩沖液，含0.01 mol/L咪唑、3.3 mol/L尿素、0.2%(體積分?jǐn)?shù))2-巰基乙醇.緩沖液B為在緩沖液A中加0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl.洗脫液流速為80 mL/h，線性洗脫.樣品制備:粗分離得到的酪蛋白和β-乳球蛋白分別溶于起始緩沖液中，0.45 μm濾膜過濾后上樣，上樣量為0.5 mL.FPLC得到的酪蛋白和乳清蛋白經(jīng)超純水透析去鹽、去尿素并經(jīng)聚乙二醇2000濃縮后備用，SDSPAGE鑒定酪蛋白和β-乳球蛋白.

1.3.5 凝膠過濾色譜純化牦牛乳酪蛋白

凝膠過濾層析的填料為Sephadex G100凝膠.用pH8.0的0.02 mol/L磷酸鹽(含3.3 mol/L的尿素)緩沖液平衡柱子(Φ1.6 cm×65 cm).500 μL的樣品(300 μL由FPLC離子交換色譜得到的 αs-酪蛋白加200 μL pH8.0的0.02 mol/L磷酸鹽)0.45 μm濾膜過濾后上樣.洗脫速度為1 mL/min，檢測器于280 nm波長處紫外檢測.得到的目標(biāo)蛋白經(jīng)超純水透析、脫鹽，并經(jīng)聚乙二醇2000濃縮后凍干，用RP-HPLC檢驗其純度.

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)方法分離牦牛乳αs-酪蛋白、β-酪蛋白和β－乳球蛋白

2.1.1 化學(xué)方法分離牦牛乳αs-和β-酪蛋白

等電點(diǎn)沉淀(pH4.6)是分離乳中酪蛋白和乳清蛋白的傳統(tǒng)方法［1］.用10%的醋酸調(diào)整脫脂乳的pH4.6，在室溫下靜置 30 min.然后溶液在3 000×g、4℃條件下離心15 min，得到酪蛋白膠束沉淀.酪蛋白膠束主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和 κ-酪蛋白組成［14］.在酪蛋白膠束中，各酪蛋白間的結(jié)合非常緊密，很難分開.而尿素作為一種蛋白質(zhì)分散劑能夠使酪蛋白膠束解聚［15］.將酪蛋白沉淀分散到6 mol/L尿素溶液中，4℃條件下靜置1 h.用去離子水稀釋溶液，使尿素的最終濃度為4.63 mol/L，再將其置于4℃條件下靜置1 h.然后溶液在3 000×g、4℃條件下離心15 min，得到 α-酪蛋白沉淀(主要含有αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白和 λ-酪蛋白).繼續(xù)用去離子水稀釋上清液，使尿素的終濃度為1.7 mol/L，并調(diào)整其pH為4.7，即得到β-酪蛋白沉淀，將其透析濃縮后，在－70℃條件下保存?zhèn)溆?

在酪蛋白膠束中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白是鈣敏感性蛋白，而κ-酪蛋白是鈣不敏性蛋白并對維持酪蛋白膠束的穩(wěn)定性起重要作用［16－17］.不同的酪蛋白對鈣的敏感性不同，其在鈣溶液中的溶解度也不同，將α-酪蛋白分散到0.4 mol/L pH7的CaCl2溶液中，在4℃下放置過夜得到 αs-酪蛋白沉淀(主要包含 αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白).得到的αs-酪蛋白沉淀透析濃縮后－70℃保存?zhèn)溆?化學(xué)分離方法得到的αs-酪蛋白和β-酪蛋白仍是混合蛋白，還需要對其進(jìn)行純化.

2.1.2 化學(xué)方法分離β-乳球蛋白

將酸乳清作為分離β-乳球蛋白的原料.酸乳清經(jīng)螯合劑檸檬酸鈉處理后其SDS-PAGE如圖1所示.可以看出，樣品中主要含有β-乳球蛋白，但還有少量的BSA.乳清中的Ca2+對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的穩(wěn)定性起著重要的作用［18－21］.α-乳白蛋白是鈣結(jié)合蛋白，每摩爾α-乳白蛋白中含有1 mol的Ca2+，Ca2+對穩(wěn)定α-乳白蛋白的空間結(jié)構(gòu)起著重要的作用［22－23］.但是當(dāng)溶液的pH低于3.9，在有鹽存在的條件下會降低鈣與α-乳白蛋白的結(jié)合能力，使用鈣螯合劑檸檬酸鈉很容易使鈣螯合，并生成α-乳白蛋白沉淀，從而使α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分離［4］.從圖 1可以看出，在pH3.9、檸檬酸鈉為螯合劑的條件下α-乳白蛋白和β-乳球蛋白得到了很好的分離.

圖1 檸檬酸鈉螯合劑沉淀酸乳清中的β-乳球蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 牦牛乳αs-酪蛋白純化

2.2.1 FPLC純化牦牛乳αs-酪蛋白

在不同的pH條件下αs-酪蛋白和β-酪蛋白的等電點(diǎn)和所攜帶的靜電荷是不同的［24］，根據(jù)該特點(diǎn)可應(yīng)用離子交換層析的方法分離αs-酪蛋白和β-酪蛋白.采用陰離子交換色譜、Cellulose DE-52為填料、含有尿素的咪唑鹽酸緩沖液在線性條件下進(jìn)行洗脫、純化經(jīng)化學(xué)分離得到的αs-酪蛋白.αs-酪蛋白在快速蛋白純化系統(tǒng)中被Cellulose DE-52介質(zhì)吸附，經(jīng)含有NaCl(0～0.4%)的洗脫液線性洗脫分兩個組分(圖2)，洗脫峰A和B.由于洗脫峰A中含有的蛋白質(zhì)的量較少，沒有收集其洗脫峰.SDS-PAGE檢測洗脫峰B如圖2所示，洗脫峰B的主要成分為αs-酪蛋白，并含一部分β-酪蛋白 (圖3).收集洗脫峰B，凍干后備用.

圖2 Cellulose DE-52陰離子交換色譜快速純化牦牛乳αs-酪蛋白結(jié)果

圖3 FPLC純化得到的αs-酪蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2.2 Sephadex G100純化牦牛乳αs-酪蛋白

相對αs-酪蛋白經(jīng)FPLC系統(tǒng)得到了很好的分離，但其組分中仍含有一部分β-酪蛋白.根據(jù)酪蛋白之間相對分子質(zhì)量上的差別，應(yīng)用葡聚糖凝膠Sephadex G100對αs-酪蛋白進(jìn)一步純化.由上步純化得到的組分B用Sephadex G100進(jìn)一步純化，色譜圖如圖4所示.收集洗脫峰C，并應(yīng)用RP-HPLC檢測，結(jié)果如圖5所示.根據(jù)色譜峰面積比計算αs-酪蛋白的純度為87.13%.

圖4 Sephadex G100純化FPLC得到的αs-酪蛋白色譜圖

圖5 RP-HPLC分離αs-酪蛋白結(jié)果

2.3 牦牛乳β-酪蛋白的純化

2.3.1 FPLC純化牦牛乳β-酪蛋白

采用FPLC對化學(xué)分離方法得到的β-酪蛋白進(jìn)一步純化.β-酪蛋白在快速蛋白純化系統(tǒng)中被Cellulose DE-52介質(zhì)吸附并經(jīng)線性洗脫后分離出來(圖6).接收β-酪蛋白洗脫峰的中間段，并用SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖7所示.洗脫峰B的主要成分為 β-酪蛋白，并含一部分 αs-酪蛋白(圖3).收集β-酪蛋白洗脫峰，凍干后備用.

圖6 Cellulose DE-52陰離子交換色譜快速純化牦牛乳β-酪蛋白結(jié)果

圖7 FPLC得到的β-酪蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.3.2 Sephadex G100純化牦牛乳β-酪蛋白

由上步純化得到的 β-酪蛋白用 Sephadex G100進(jìn)一步純化，色譜圖如圖8所示.收集β-酪蛋白洗脫峰，并應(yīng)用RP-HPLC鑒定，結(jié)果如圖9所示.根據(jù)色譜峰面積比計算β-酪蛋白的純度為88.58%.

圖8 Sephadex G-100純化FPLC得到的β-酪蛋白色譜圖

圖9 RP-HPLC分離β-酪蛋白結(jié)果

2.4 FPLC純化牦牛乳β-乳球蛋白

采用FPLC對化學(xué)分離方法得到的β-乳球蛋白進(jìn)一步純化.β-乳球蛋白在快速蛋白純化系統(tǒng)中分出3個峰，其中洗脫峰A為BSA，洗脫峰B和C為β-乳球蛋白(圖10).因為β-乳球蛋白為二聚體，在FPLC系統(tǒng)中被分成了兩個峰.接收β-乳球蛋白洗脫峰B和C，并用RP-HPLC檢測，如圖11所示，其純度為80.00%.收集β-乳球蛋白洗脫峰，凍干后備用.

圖10 Cellulose DE-52陰離子交換色譜快速純化牦牛乳β-乳球蛋白結(jié)果

圖11 RP-HPLC分離β-乳球蛋白結(jié)果

3 結(jié)語

根據(jù)酪蛋白對鈣的敏感性不同和不同pH條件下酪蛋白在不同濃度尿素溶液中的溶解度不同，將酪蛋白粗分級為α-酪蛋白和β-酪蛋白.又利用FPLC陰離子交換層析技術(shù)和Sephadex G100凝膠層析技術(shù)對粗分級的α-酪蛋白和β-酪蛋白進(jìn)行純化，得到純度分別為87.13%和88.58%的α-酪蛋白和β-酪蛋白.以檸檬酸鈉為螯合劑，在低pH3.9條件下分離出了β-乳球蛋白，并經(jīng)FPLC純化后得到純度為80.00%的β-乳球蛋白.

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Separation and purification of major allergens in yak milk

LI Hai-mei1，MA Ying1，CUI Yan-hua1，WANG Jia-qi2，LI Qi-ming2，HE Sheng-hua1

(1.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China;2.Research and Development Central of New Hope Dairy Company，610041 Chengdu，China)

The major allergens in yak milk were obtained by chemical methods，and purified by a fast protein liquid chromatography(FPLC)combined gel chromatography in order to analyze allergenicity of protein in yak milk.Casein and whey were isolated after adjusting isoelectric precipitating of skimmed milk to 4.6 by adding 10%acetic acid.Based on differential solubility in urea solutions and differential sensitivity of calcium，αscasein and β-casein were separated from whole casein.And then，the crude fractions of αs-casein，β-casein were further separated using anion-exchange FPLC and Sephadex G100 column.β-lactoglobulin was separated from acid whey using chelating of citrate sodium at low pH in the presence of salt and purified by FPLC.The results of RP-HPLC showed that the purities of αs-，β-casein，and β-lactoglobulin were 87.13% ，88.58% ，and 80.00%，respectively.

yak milk;casein separation;β-lactoglobulin separation;fast protein liquid chromatography(FPLC)

TS252

A

0367－6234(2012)04－0080－06

2011－04－15.

國家自然科學(xué)基金資助項目(30871953).

李海梅(1974—)，女，博士研究生，講師;

馬 鶯(1961—)，女，教授，博士生導(dǎo)師.

李海梅，haimeili@hit.edu.cn.

(編輯 劉 彤)