郭長虹，劉慶國，劉佳莉，束永俊，呂月萍，余建平

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150025哈爾濱)

目前，轉(zhuǎn)基因植物風(fēng)險(xiǎn)評估［1-2］主要集中在轉(zhuǎn)基因植物與近緣物種的基因轉(zhuǎn)移［3］、目標(biāo)害蟲的抗性［4］，以及對非目標(biāo)生物的多樣性和生態(tài)系統(tǒng)的影響［1，2，5］.土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程的重要場所，而土壤生物多樣性與活性是該系統(tǒng)保持健康穩(wěn)定的基礎(chǔ)［6］.轉(zhuǎn)基因作物根系分泌物的釋放有可能引起微生物多樣性和結(jié)構(gòu)的改變，所以，轉(zhuǎn)基因作物對土壤生態(tài)環(huán)境、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的改變是轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)評價(jià)中重要的內(nèi)容［7］.到目前為止，研究主要集中在核轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響，而葉綠體轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物影響的報(bào)道很少.由于葉綠體基因組的拷貝數(shù)高，葉綠體轉(zhuǎn)基因植物的外源基因表達(dá)量非常大，可達(dá)核轉(zhuǎn)基因植物的幾十倍、甚至幾百倍.大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入土壤，可能使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)功能的改變.因此，評價(jià)葉綠體轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物群落的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義.

本研究以aadA基因葉綠體轉(zhuǎn)化煙草為材料，利用微生物稀釋平板法和Biolog檢測，比較aadA基因葉綠體轉(zhuǎn)化煙草與對照煙草在苗期、花期和成熟期土壤微生物群落和功能的變化，為評價(jià)葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供依據(jù).

1 試驗(yàn)

1.1 植物材料及種植

葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草(轉(zhuǎn)aadA基因，TA)及對照煙草(WT)由本實(shí)驗(yàn)室提供.田間種植采用完全隨機(jī)區(qū)組，3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草相間種植.

1.2 土壤采集

分別在煙草的苗期、花期、成熟期隨機(jī)抽取大田種植的煙草，采用抖落法取根系表層1～2 mm土壤［8］，每次每個(gè)重復(fù)取3株煙草并將其根際土壤混合，過2 mm土壤篩備用.

1.3 微生物數(shù)量測定

采用平板稀釋分離培養(yǎng)法.土壤微生物數(shù)量分細(xì)菌、真菌和放線菌3大類群測定，采用平板稀釋法統(tǒng)計(jì)數(shù)量.細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng);真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng);放線菌用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)［9］.

1.4Biolog分析

稱取5 g土壤加入到裝有45 mL滅菌NaCl溶液的三角瓶中(濃度為0.145 mol/L)，然后在旋轉(zhuǎn)振蕩器上震蕩30 min搖勻.土壤溶液依次稀釋至10-3，向Biolog EcoPlate(美國BIOLOG公司)上每孔加入150 μL土壤稀釋液，然后在室溫條件下(28℃)將微孔板放在保濕容器中避光培養(yǎng)，每隔24 h用酶標(biāo)儀讀取在590 nm(顏色+濁度)和750 nm(濁度)波長的數(shù)值.

單孔平均光密度值計(jì)算按照Garland和Mills的方法［10］，即每孔平均吸光度變化率RAWCD(590～750 nm)=Σ(C590～750)/31，其中31為Biolog EcoPlate上供試碳源的種類數(shù).

采用培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)計(jì)算微生物群落的多樣性指數(shù)［11］.Shannon指數(shù)H'用于評估豐富度，H'=-Σ(Pi×ln Pi)E=H'/ln s，其中Pi為第i孔的相對吸光值與整個(gè)平板相對吸光值總和的比率，s為顏色變化孔的數(shù)目;Simpson指數(shù)D是用于評估常見種優(yōu)勢度的指數(shù)，D=1-Σ(Pi×Pi)，其中Pi為第i孔的相對吸光值與整個(gè)平板相對吸光值總和的比率;Mcintosh指數(shù)U是基于群落物種多維空間距離的多樣性指數(shù)，為一致性的量度，，其中ni為第i孔的相對吸光值.

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel和SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析(P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義).同列數(shù)據(jù)后具有相同字母者，表示在0.05水平上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.RAWCD折線圖采用SigmaPlot 2000軟件，PCA圖由MATLAB軟件做出.

2 結(jié)果與分析

2.1 aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草對根際土壤微生物數(shù)量的影響

對苗期、花期、成熟期土壤中微生物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1).結(jié)果表明，在各個(gè)生育期內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量苗期最小，花期最大，成熟期有所降低;放線菌、真菌數(shù)量苗期最低，花期增加，成熟期最大.所有在3個(gè)不同時(shí)期的WT根際微生物的數(shù)量均略高于TA根際的微生物數(shù)量，這一趨勢很明顯，但都沒有達(dá)到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平.說明在試驗(yàn)期間aadA葉綠體轉(zhuǎn)化煙草的種植對各個(gè)時(shí)期的根際土壤微生物數(shù)量沒有影響.

表1 煙草根際微生物數(shù)量分析

2.2 aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草對根際土壤微生物活性的影響

對苗期、花期、成熟期aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草土壤微生物進(jìn)行Biolog分析(圖1).結(jié)果表明，各個(gè)時(shí)期內(nèi)aadA葉綠體轉(zhuǎn)化煙草根際土壤微生物群落的RAWCD變化曲線與野生型煙草根際土壤的RAWCD變化曲線接近吻合.說明在試驗(yàn)期間aadA葉綠體轉(zhuǎn)化煙草對土壤微生物的整體活性影響很小，轉(zhuǎn)基因煙草根際土壤中的微生物群落對微平板上碳底物利用的能力和對照土壤差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

圖1 不同生育期煙草根際土壤微生物RAWCD隨時(shí)間的變化

2.3 土壤微生物群落功能多樣性分析

進(jìn)一步對不同生育期煙草土壤細(xì)菌群落Biolog EcoPlate底物碳源代謝主成分進(jìn)行了分析(圖2).結(jié)果表明，aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草在苗期、花期和成熟期主成分都有交集，說明在這3個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草根際土壤細(xì)菌群落對底物碳源的代謝特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

圖2 不同生育期煙草土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

對苗期、花期、成熟期3個(gè)時(shí)期兩種土壤微生物功能多樣性進(jìn)行了分析(表2).結(jié)果表明，aadA葉綠體轉(zhuǎn)化煙草和野生型煙草根際微生物種群在Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Mcintosh指數(shù)和Shannon均勻度方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.說明在試驗(yàn)期間aadA葉綠體轉(zhuǎn)化煙草的種植對根際土壤微生物功能多樣性沒有影響.

表2 根際微生物群落多樣性指數(shù)分析

3 討論

自轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，其對環(huán)境的影響一直備受關(guān)注.現(xiàn)已知多種作物的多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系及其殘?bào)w可以改變作物土壤微生物群體的組成，但這些改變也同時(shí)受田間土壤性質(zhì)、季節(jié)變化和評估方法等的影響［12］.Yudina等［13］發(fā)現(xiàn)4種不同轉(zhuǎn)Bt基因棉花促使了土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量發(fā)生短暫性的顯著增加.Dunfield和Gernuda［14］研究了在加拿大的4個(gè)不同田塊連續(xù)兩年種植4種轉(zhuǎn)抗除草劑基因的油菜和4種常規(guī)油菜品種對根際微生物多樣性的影響.結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因油菜品種細(xì)菌群落與常規(guī)品種有差異.轉(zhuǎn)基因油菜的根際微生物群落在一些脂肪酸上顯著偏高，表明其微生物群落組成發(fā)生了變化.近年來，國內(nèi)學(xué)者也陸續(xù)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響的研究成果.王洪興等［15］的研究表明，土壤中施入轉(zhuǎn)Bt基因稻稈后細(xì)菌數(shù)量顯著低于施入非轉(zhuǎn)基因稻稈后土壤中的細(xì)菌數(shù)量，但對于真菌結(jié)果正好相反，放線菌數(shù)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.沈法富等［7］在大田栽培條件下，連續(xù)兩年測定棉花不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK12和對照品種泗棉三號之間對土壤微生物的影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根際微生物和細(xì)菌生理群的數(shù)量發(fā)生了變化，且根際細(xì)菌生理群分布的均勻度下降.袁紅旭等［16］對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶雙價(jià)抗真菌基因水稻種植后的根際土壤微生物群落進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤中真菌和細(xì)菌數(shù)量明顯少于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，與常規(guī)水稻品種數(shù)量接近.陳敏等［17］的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)Bt水稻根際土壤的細(xì)菌生理類群無論在數(shù)量或是結(jié)構(gòu)組成上均明顯不同于常規(guī)水稻.李本金等［18］通過溫室模擬試驗(yàn)，評估了抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量的影響.結(jié)果表明，在水稻整個(gè)生長發(fā)育過程中，供試轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.本研究以aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵轂椴牧?，分別于苗期、花期、成熟期對種植在大田中的aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草與對照煙草根際土壤可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，所有在3個(gè)不同時(shí)期的WT根際微生物的數(shù)量均要略高于TA根際的微生物數(shù)量，但都沒有達(dá)到差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平，說明在試驗(yàn)期間aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因與對照植株根際土壤微生物在數(shù)量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

微生物功能多樣性信息對于明確不同環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義.以Biolog微孔板碳源利用為基礎(chǔ)的定量分析為描述微生物群落功能多樣性提供了一種更為簡單、快速的方法，并廣泛應(yīng)用于評價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性［19-21］.Griffiths等［22］利用Biolog法研究表明，轉(zhuǎn)凝集素基因馬鈴薯對根際微生物群落功能多樣性沒有產(chǎn)生影響.阮妙鴻等［23］利用Biolog結(jié)合微生物的平板培養(yǎng)研究了轉(zhuǎn)ScMV-CP基因甘蔗對根際土壤微生物的影響.結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤微生物的數(shù)量和均勻度有一定影響，但對其活性和多樣性則影響不明顯.本研究利用Biolog技術(shù)分析了aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草的種植對根際土壤微生物群落功能多樣性的影響.結(jié)果表明，在3個(gè)不同時(shí)期aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草與對照煙草根際土壤微生物在RAWCD變化曲線、主成分、微生物群落指數(shù)等方面均有一定差異，但差異均沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平.說明在試驗(yàn)期間aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草的種植對根際微生物群落功能多樣性沒有影響.

本研究首次在大田條件下研究了不同生育期aadA葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草對土壤微生物數(shù)量和功能多樣性的影響.今后，還將對不同基因型的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草采用更多的方法(如DGGE)，進(jìn)行更長時(shí)間的跟蹤，從而更加全面、客觀地評價(jià)葉綠體轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物群落的影響.

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