鞏志國(guó)，蘇敏，員麗娟，李世雨，季新成

(新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，烏魯木齊 830063)

液相色譜法測(cè)定番茄制品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留量*

鞏志國(guó)，蘇敏，員麗娟，李世雨，季新成

(新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，烏魯木齊 830063)

建立了測(cè)定番茄制品中鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留量的凈化方案。樣品中的殘留物用磷酸鹽緩沖液(pH 4)提取，經(jīng)分散固相萃取法初步凈化后，再經(jīng)串聯(lián)雙柱固相萃取凈化，用RP C18(Symmetry Shield)色譜柱在梯度洗脫下分離待測(cè)物，外標(biāo)法定量。鏈霉素的線性范圍為0.05～0.8 mg/L，相關(guān)系數(shù)r＞0.999 8。方法的回收率為71%～95%，定量限(S/N=10)為0.1 mg/kg，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～10.5%。該方法操作簡(jiǎn)便，凈化效果好，靈敏、準(zhǔn)確，檢測(cè)成本低，適用于檢測(cè)和分析番茄制品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留量。

番茄；鏈霉素；雙氫鏈霉素；串聯(lián)雙柱凈化；液相色譜

鏈霉素(Streptomycin)屬于氨基糖苷類抗生素中的常用藥物，對(duì)多種植物細(xì)菌性病害有良好的防治效果，如可以有效地防治西紅柿青枯病和黃瓜細(xì)菌性角斑病等。但是，該抗生素對(duì)人體有一定的毒副作用，如果食品中殘留過(guò)量的鏈霉素，則會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害，鏈霉素還具有潛在的致畸、致突變和致癌作用［1］。日本肯定列表中對(duì)于番茄中鏈霉素和雙氫鏈霉素總量的限量為0.3 mg/kg［2］。目前，我國(guó)是世界第一大番茄制品出口國(guó)，番茄制品是我國(guó)重要的農(nóng)產(chǎn)品出口品種之一。番茄制品中鏈霉素殘留量檢測(cè)方法的建立，對(duì)提高我國(guó)番茄制品檢測(cè)技術(shù)水平，促進(jìn)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品對(duì)外出口具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留的檢測(cè)技術(shù)已有大量的研究，常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法［3］、分光光度法［4］、液相色譜法［5］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［6］等。文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)方法前處理比較復(fù)雜，有時(shí)需要經(jīng)過(guò)兩次固相萃取小柱的凈化，耗時(shí)長(zhǎng)，試劑消耗量大，凈化效果也不理想。

筆者采用分散固相萃取初凈化和串聯(lián)雙柱固相萃取凈化相結(jié)合的前處理方法，建立了優(yōu)化的番茄中鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留量的液相色譜檢測(cè)技術(shù)，該法的檢出限為0.1 mg/kg，能夠滿足日本肯定列表對(duì)于番茄中鏈霉素和雙氫鏈霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695型，美國(guó)沃特斯公司，配有熒光檢測(cè)器，美國(guó)沃特斯公司；

渦旋儀：MS3型，德國(guó)IKA公司；

超聲儀：SK8200LH型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；

高純水發(fā)生器：Milli-QⅡ型，美國(guó)密理博公司；

離心機(jī)：T–124型，瑞士KONTRON公司；

固相萃取裝置：20孔，美國(guó)安捷倫公司；

氮吹儀：N–EVAP112型，美國(guó)Organomation公司；

鏈霉素和雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer Gmb H公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

反相固相萃取柱：200 mg/6 mL，美國(guó)菲羅門(mén)公司；

弱陽(yáng)離子交換柱：200 mg/6 mL，美國(guó)菲羅門(mén)公司；

硅藻土：分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠；

有機(jī)系濾膜：0.2 μm，美國(guó)安捷倫公司；

番茄及制品樣品：市售；

所用其它試劑均為優(yōu)級(jí)純；

實(shí)驗(yàn)用水為二次凈化水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取適量鏈霉素和雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用0.3%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸水溶液配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于–18℃冰箱，保存期18個(gè)月。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用0.3%甲酸水溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品提取液

磷酸鹽緩沖溶液的配制：稱取1.36 g的KH2PO4溶解到950 mL水中，用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH 4，加入0.15 g的Na2EDTA·2H2O，充分溶解，最后用水定容至1 000 mL。

1.3 色譜條件

液相色譜柱：Symmetry Shield RP C18(美國(guó)沃特斯公司)；流動(dòng)相：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉–乙腈(體積比為78∶22)；流速：0.7 mL/min；柱溫：35℃；激發(fā)波長(zhǎng)：263 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：447 nm。

柱后衍生條件：0.6 mmol/L 1，2-萘醌-4-磺酸鈉溶液，0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，流速為0.4 mL/min，衍生柱溫為50℃。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取

稱取5.0 g樣品，加入樣品提取液，并定容到20 mL。渦旋儀上渦旋1 min，超聲30 min，以8 000 r/min離心10 min，離心后的上清液待后續(xù)凈化。

1.4.2 初凈化

取7.0 mL上述離心后的上清液于15 mL離心管中，同時(shí)往離心管中加入0.8 g的硅藻土，充分渦旋1 min，超聲10 min，以4 000 r/min離心10 min，離心后的上清液待再凈化。

1.4.3 串聯(lián)雙柱再凈化

依次用5.0 mL甲醇、5.0 mL水分別活化反相固相萃取柱和弱陽(yáng)離子交換固相萃取柱，待上述活化溶液全部流出后，用固相萃取柱轉(zhuǎn)接頭串接好反相固相萃取柱(在上部：柱1)和弱陽(yáng)離子交換固相萃取柱(在下部：柱2)，取1.4.2中待凈化的上清液4.0 mL加入柱1中，控制流速約為1.0 mL/min通過(guò)兩串接的固相萃取柱。待凈化液全部流出后，再加入6.0 mL提取液于柱1中。等待柱1中淋洗液全部流出后，從上部去除柱1，在柱2中依次加入6.0 mL水和1.0 mL甲醇淋洗柱2，柱2中淋洗液全部流出后，抽干3.0 min，用6.0 mL的甲醇(含體積分?jǐn)?shù)3%的甲酸)溶液洗脫柱2中的待測(cè)物，用10 mL試管接收洗脫液，洗脫液于50℃水浴下氮?dú)獯蹈?，?.5 mL的乙腈–水溶液(含0.2%甲酸，70∶30)溶解殘?jiān)?，充分渦旋1 min，超聲2 min，過(guò)0.2 μm的有機(jī)系濾膜，濾液供高效液相色譜測(cè)定。

1.5 色譜圖

在1.3色譜條件下，0.1 mg/L鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 0.1 mg/L鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

參考待測(cè)物的性質(zhì)和文獻(xiàn)［7］，選擇反相C18色譜柱分離待測(cè)物。由于鏈霉素和雙氫鏈霉素的極性均較強(qiáng)，在反相色譜柱上幾乎沒(méi)有保留，需要離子對(duì)試劑才能使待測(cè)物在反相柱上有保留。本實(shí)驗(yàn)選擇了庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑。

2.2 提取液的選擇

鏈霉素和雙氫鏈霉素常用的提取液有磷酸溶液和磷酸鹽的緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用磷酸溶液提取和凈化后，測(cè)定待測(cè)物的峰型和靈敏度均較差；而用磷酸鹽的緩沖溶液提取和凈化后效果較好。在磷酸鹽的緩沖溶液中加入少量的乙二胺四乙酸鈉能維持溶液的穩(wěn)定性，同時(shí)能與一些陽(yáng)離子形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，這或許能減少對(duì)弱陽(yáng)離子交換柱凈化的干擾。

2.3 凈化條件的選擇

因番茄成分復(fù)雜，單一固相萃取柱對(duì)番茄中干擾雜質(zhì)凈化效果不佳，因此需要多重凈化的方法去除番茄中干擾雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取初步凈化和兩個(gè)串聯(lián)固相萃取柱再凈化的方法來(lái)去除番茄中影響鏈霉素測(cè)定的干擾雜質(zhì)。

分散固相萃取初凈化主要利用一些吸附劑(如佛羅里硅土、硅藻土和活性炭)來(lái)去除樣品中的極性或非極性干擾物。實(shí)驗(yàn)了佛羅里硅土、硅藻土和活性炭等吸附劑，結(jié)果表明，硅藻土能較好地吸附番茄中一些色素和酸類等物質(zhì)而又不會(huì)吸附待測(cè)物。

再凈化的目的是去除一些極性、非極性物質(zhì)和初凈化未去除的色素和酸類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)利用固相萃取柱(SPE)再凈化。SPE柱通常有兩種使用方式，一種是利用SPE 柱保留住待測(cè)物；另一種是利用SPE 柱保留住一些干擾物質(zhì)。文獻(xiàn)中有利用反相柱和離子交換柱分兩次凈化［6］，此操作需要離子對(duì)試劑，且洗脫試劑的用量大，操作繁瑣費(fèi)時(shí)。筆者利用反相柱(上部：柱1)和離子交換柱(下部：柱2)串接起來(lái)同時(shí)凈化樣品。考慮到待測(cè)物極性較強(qiáng)，在柱1中幾乎無(wú)保留，以弱酸性緩沖溶液為提取試劑，待測(cè)物在溶液中以離子化方式存在，提取溶液通過(guò)柱1時(shí)，一些非極性雜質(zhì)主要被保留在柱1中，而待測(cè)物則無(wú)保留地通過(guò)柱1進(jìn)入柱2中。柱2是弱陽(yáng)離子交換柱，主要保留離子化合物，待測(cè)物被保留在柱2中，而一些非離子化的物質(zhì)在柱2中沒(méi)有保留。為了避免反向柱中有殘留的待測(cè)物，用提取液再淋洗雙柱，淋洗不僅洗脫了柱1中殘留的待測(cè)物于柱2中，同時(shí)也洗脫掉了柱2中殘留的雜質(zhì)。用水和甲醇淋洗柱2，除去易溶于水相和有機(jī)相的雜質(zhì)。最后用酸化的有機(jī)相洗脫液洗脫柱2中的待測(cè)物供后續(xù)處理。雙SPE柱串聯(lián)起來(lái)同時(shí)凈化比用單一SPE柱［5］和分別用兩個(gè)SPE柱凈化［6］可節(jié)省大量溶劑，且具有操作簡(jiǎn)單快速、凈化效果好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 檢出限和定量限

采用陰性番茄樣品作為空白基質(zhì)，配制不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，鏈霉素的濃度分別為0.05，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/L。鏈霉素的線性回歸方程為Y=1.49×104X＋2.85×105，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，線性范圍為0.05～0.8 mg/L，檢出限為0.05 mg/kg (S/N＞3)，定量檢測(cè)限為0.1 mg/kg(S/N＞10)。

2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

利用空白番茄樣品進(jìn)行3個(gè)添加水平的回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)5次。鏈霉素的添加量均為0.1，0.4，0.8 mg/kg 3個(gè)水平，回收率和精密度的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 番茄醬中的回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.6 樣品測(cè)定

將本方法用于實(shí)驗(yàn)室中24個(gè)番茄樣品的分析，對(duì)樣品中的鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)化合物的色譜保留時(shí)間來(lái)鑒別樣品。所測(cè)定的樣品中均未定量檢出鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留(低于0.1 mg/kg)。

3 結(jié)論

采用磷酸鹽緩沖溶液提取番茄制品中鏈霉素和雙氫鏈霉素，分散固相萃取和雙柱串聯(lián)同時(shí)凈化（雙柱串聯(lián)同時(shí)凈化的方法為首次采用），凈化效果好。本方法不僅可用于番茄和番茄制品中鏈霉素或雙氫鏈霉素殘留量的液相色譜測(cè)定，也可適用于蔬菜和水果中鏈霉素或雙氫鏈霉素殘留量的測(cè)定。

［1］ 胡昌勤.鏈霉素的免疫學(xué)［J］.國(guó)外醫(yī)藥： 抗生素分冊(cè)，1989，10(1): 39–42.

［2］ 食品安全網(wǎng).農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)［EB/OL］.［2011–03–28］. http:// www.tbt-sps.gov.cn/foodsafe/xlbz/Pages/pesticide.aspx.

［3］ 范國(guó)英，王建華，王自良，等.鏈霉素殘留快速檢測(cè)阻斷ELISA試劑盒的研制及其性能測(cè)定［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44(1): 82–84.

［4］ 李英嬌，羅小玲，羅瑞峰，等.熒光分光光度法測(cè)定番茄中鏈霉素殘留［J］.食品工業(yè)，2008(5): 69–71.

［5］ 陳曉紅，劉小莉，董明盛，等.高效液相色譜法測(cè)定蜂產(chǎn)品中鏈霉素殘留量［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2004，23(10): 30–32.

［6］ 劉曉茂，趙淑軍，張進(jìn)杰，等.蜂蜜中鏈霉素與雙氫鏈霉素殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27(12): 1 351–1 354.

［7］ 孫雷，張?bào)P，黃耀凌，等.牛奶中鏈霉素與雙氫鏈霉素殘留檢測(cè)的液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法研究［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27(11): 180–186.

Determination of Streptomycin and Dihydrostreptomycin Residues in Tomato Products by HPLC

Gong Zhiguo， Su Min ， Yun Lijuan， Li Shiyu， Ji Xincheng
(Technique Center of Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， ürümqi 830063， China)

The method was speci fi cally developed for optimizing the puri fi cation method of determination of streptomycin and dihydrostreptomycin residues in tomato products. The residues were extracted from the samples with phosphate buffer solution (pH 4). The clean-up was performed by the way of dispersive solid-phase extraction and tandem dual solidphase extraction column. The RP C18column(Symmetry Shield) was used to complete the separation of the analytes under gradient elution. The external standard calibration curves were used for the quantitative determination. The linear range was from 0.05 to 0.8 mg/L with a good linear relationship (r＞0.999 8). The limits of quanti fi cation (LOQ) were 0.1 mg/kg for streptomycin and dihydrostreptomycin. The recovery ranges were from 71% to 95% with the relative standard deviations (RSD) between 2.6% and 10.5%. It was indicated that this method is easer, more sensitive and has a better puri fi cation effect. The method was accurate and speci fi c to monitor and analyze streptomycin and dihydrostreptomycin residues in tomatoes and its products.

tomato; streptomycin; dihydrostreptomycin; tandem dual solid-phase extraction column clean up; liquid chromatography

O657.7

A

1008–6145(2012)03–0035–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.010

* 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（2010xk0048）

聯(lián)系人：季新成； E-mail: xjciqgong@163.com

2012–03–30