張?zhí)烊A，敖日格樂，王純潔，斯木吉德，滿 達，孫和濤

（1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

大腸埃希菌（E.coli）通常稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年發(fā)現的，在相當長的一段時間內，一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸埃希菌對人和動物有致病性，尤其對嬰兒和幼畜（禽），不論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，大腸埃希菌仍是新生兒敗血癥的常見致病菌[1]。相關資料顯示，雞大腸桿菌病的發(fā)病率占雞細菌性疾病的33%，居首位[2]；由大腸埃希菌引起的仔豬腹瀉，主要指仔豬黃白痢，在養(yǎng)豬場中有較高的發(fā)病率和病死率；人們通過消費處理不當的牛產品感染大腸埃希菌，其中甚至包括對人類健康極度危險的出血性結腸炎（HC）、溶血性尿毒綜合征（HUS）等疾病，是由于食用牛肉和牛奶而發(fā)生[3－4]；現階段奶牛乳房炎發(fā)病率較高，原因是由許多革蘭陽性菌和革蘭陰性菌引起的，在革蘭陰性菌中，由致病性大腸埃希菌引起的奶牛發(fā)病率較普遍。主要是由于胃腸道下端的致病性大腸埃希菌，隨糞便排出后，導致環(huán)境污染，引起動物發(fā)病。但國內報道從健康牛的糞中分離到致病性大腸埃希菌的報道很少，而且致病性大腸埃希菌血清型眾多，分布復雜，具有很強的存活率，如果不及時采取有效防控措施，會給人類和動物帶來很大的危害，早發(fā)現、早控制成為首要重任。為了更早、更快的發(fā)現病因，對健康牛的糞中大腸埃希菌的研究迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞樣 新鮮糞樣采集自內蒙古包頭市薩拉齊侯家營奶牛場77頭外表健康成年泌乳荷斯坦奶牛。

1.1.2 培養(yǎng)基 伊紅美藍瓊脂（EMB）、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯等購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.1.3 生化鑒定管 葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、衛(wèi)茅醇、尿素、葡萄糖磷酸鹽胨水、硝酸鹽（還原）、半固體瓊脂、三糖鐵瓊脂等購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.1.4 實驗動物 選用18g～22g健康的昆明小鼠（雌雄性各半），購自內蒙古大學實驗動物研究中心。

1.1.5 大腸埃希菌標準抗O血清 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 糞樣的采集 用無菌橡膠手套從77頭外表健康成年泌乳荷斯坦奶牛肛門采集直腸新鮮糞樣，分別裝入標記好的無菌封口袋中立即送實驗室。

1.2.2 細菌分離純化培養(yǎng) 用接種環(huán)取采集的新鮮糞樣接種于伊紅美藍瓊脂，37℃培養(yǎng)24h后，挑取EMB瓊脂平板上紫黑色帶金屬光澤的單個可疑菌落接種于普通瓊脂斜面37℃培養(yǎng)24h后獲得純培養(yǎng)，鏡檢并4℃冰箱保存?zhèn)溆?。挑取EMB瓊脂平板上紫黑色帶金屬光澤的單個菌落涂片，革蘭染色鏡檢觀察菌落的形態(tài)及染色特性照相并做記錄。

1.2.3 生化試驗 按生化鑒定管使用說明書進行鑒定。

1.2.4 動物致病性試驗 取過夜培養(yǎng)肉湯菌液（細菌濃度1×108個／mL），試驗組小鼠腹腔接種0.2 mL／只，陰性對照組注射滅菌營養(yǎng)肉湯0.2mL／只，每個菌株攻2只試驗小鼠。觀察小鼠發(fā)病和存活情況，并在小鼠死亡后，立即取心血、肝臟、脾進行細菌分離鑒定。

1.2.5 血清型分型 按照大腸埃希菌O抗原定型血清說明書進行鑒定，采用玻板凝集試驗方法。將普通瓊脂斜面培養(yǎng)物用5g／L石炭酸生理鹽水2 mL洗下，置121℃高壓蒸汽滅菌2h，制成凝集抗原之后，將高壓抗原與大腸埃希菌O抗原定型血清各取一鉑耳置玻板上混勻，30s內出現明顯凝集者為“陽性”反應，反之為“陰性”反應。同時以凝集抗原與5g／L石炭酸生理鹽水混合物作對照。

2 結果

2.1 培養(yǎng)特性

分離菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上生長良好，均為紫黑色帶金屬光澤、光滑、濕潤、隆起的中等大小圓形菌落，在三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基上，底層由紅色變?yōu)辄S色、產氣，斜面由紅色變?yōu)辄S色。

2.2 形態(tài)特性

分離菌經革蘭染色鏡檢可見中等大小革蘭陰性紅色短桿菌，兩端鈍圓，單個或成對散在排列。

2.3 生化試驗

分離到69株疑似大腸埃希菌，經生化特性鑒定結果分析，符合大腸埃希菌的特性。因此，證明此69株疑似大腸埃希菌是致病性大腸埃希菌（表1）。

2.4 動物致病性試驗

分離菌的動物致病性試驗結果表明，69株分離菌中12株均在16h～27h內致死實驗小鼠，陰性對照組小鼠全部存活，7d后剖檢未見有病變。試驗組小鼠死前均可見昏睡、厭食、被毛蓬松、精神萎靡、尾巴和腹部發(fā)鉗、呼吸急促、四肢僵直直至死亡。剖檢死亡鼠，腹腔內有纖維性滲出物，胃腸膨脹，肝腫大，表面有小出血點，心包膜、腎有不同程度的出血。將其心血接種于EMB瓊脂上培養(yǎng)后，均符合注射分離菌培養(yǎng)特征。

2.5 血清學鑒定結果

對分離的12株牛源致病性大腸埃希菌進行“O”血清鑒定，分屬7種血清型（表2）。

表1 大腸埃希菌菌株生化特性鑒定結果Table1 Biochemical characteristics of E.coli strains

表2 包頭市牛源致病性大腸埃希菌O血清型（株）Table2 O serotype of bovine pathogenic E.coli isolates from Baoto city

3 討論

本試驗對內蒙古包頭市侯家營奶牛場77頭成年泌乳荷斯坦奶牛的新鮮糞樣進行了大腸埃希菌的分離培養(yǎng)。經形態(tài)特征、培養(yǎng)特性的研究，共分離出69株疑似大腸埃希菌菌株。小鼠致病性試驗結果表明，69株疑似大腸埃希菌中12株為致病性菌株，16h～27h內致死全部小鼠，證明這些菌株毒力較強。12株致病性大腸埃希菌的血清型分別為O78、O6、O9、O98、O1、O8、O149等7種血清型。與斯木吉德等[5]對包頭市某奶牛場中致病性大腸埃希菌的6種血清型 O78、O2、O8、O86、O35、O1和于俊娥等[6]對呼和浩特某奶牛場中致病性大腸埃希菌的3種血清型O1、O2、O8相比，O1型分布最廣泛，其次為O78、O8、O2。以上研究說明，大腸埃希菌的血清型及分布較為復雜，不同的地區(qū)存在有相同的血清型如O1，同一地區(qū)不同的奶牛場存在有不同的血清型，如侯家營的 O149、O98；其他奶牛場的 O86、O35。建議各地在進行大腸埃希菌病的免疫預防接種時，所用疫苗的血清型一定要與當地流行菌株相吻合。

大腸埃希菌的抗原構造及血清型極為復雜，按抗原成分不同，可將病原性大腸埃希菌分為許多血清型。血清型與致病性有著密切的關系，有些血清型只能引起一種動物發(fā)病，而另一些血清型則能引起多種動物發(fā)病。本次試驗分離鑒定出7種大腸埃希菌O抗原血清型，分屬于O78、O6、O9、O98、O1、O8、O149，據文獻報道致病性大腸埃希菌血清型中，O78、O1、O35、O2等 4 種血清型為優(yōu)勢血清型[7]，而本試驗中也鑒定出了O1和O78兩種血清型。O78能引起犢牛敗血癥[8－9]，雞壞死性腸炎[10]；O8、O9、O149可致初生仔豬腹瀉，與國外報道相符[11]；O98可以引起奶牛乳房炎[12]，但O6引起的大腸桿菌病的報道極為少見，有待進一步的研究。

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