肖 雄，鄧玉金，趙海龍，吳有博，李躍民

（西南大學動物科技學院，重慶400715）

耳皮膚成纖維細胞因具有取材方便、易獲取、體外增殖能力強、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、較易進行傳代培養(yǎng)和不易發(fā)生轉(zhuǎn)化等特點，在體細胞核移植、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、治療性克隆和誘導性多能干細胞等研究領(lǐng)域具有重要的應用價值。但是，體外培養(yǎng)的細胞，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞各種生物學特征會逐漸發(fā)生變化，同時，長期傳代也會造成資源浪費。因此，在細胞傳代過程中，需要適時進行細胞冷凍保存，以保證體外培養(yǎng)細胞的質(zhì)量，又便于取用。液氮（－196℃）冷凍保存細胞，理論上是無限久的，但由于目前技術(shù)局限，凍存時間越長，細胞復蘇后存活率越低。因此，細胞在不同凍存溫度、不同凍存方法和不同冷凍保護劑下凍存效率存在差異。本試驗以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或甘油（glycerol，GL）作為冷凍保護劑，并添加胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）組成冷凍保護液，分別采用4種冷凍降溫方法，對體外培養(yǎng)的第3代小鼠耳皮膚成纖維細胞進行冷凍保存。通過比較不同處理組復蘇后細胞的存活率和培養(yǎng)48 h后的細胞貼壁率，探討不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞解凍復蘇后細胞存活率和貼壁率的影響，并對適宜冷凍方法所得小鼠耳皮膚成纖維細胞的生長曲線進行研究，旨在篩選適宜的小鼠耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存體系，為小鼠耳皮膚成纖維細胞用于體細胞核移植和重編程為多能干細胞等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明系小鼠，8周齡～10周齡雌鼠，體重23 g～28 g，購于重慶市中藥研究所動物研究中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM粉末，Gibco公司產(chǎn)品；DMSO，GL，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）Sigma公司、杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。

CO2培養(yǎng)箱（3111）Thermo Forma公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡（T－DH）Nikon Japan公司產(chǎn)品；超低溫冰箱（720）Thermo Electron Corporation公司產(chǎn)品；液氮罐（YDS－30B）成都液氮容器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠耳皮膚組織的獲取 頸椎脫臼法處死小鼠，手術(shù)刀片剔除耳毛，經(jīng)酒精消毒，用無菌眼科剪剪取耳朵，稱重后，置于加有750 mL／L酒精的玻璃培養(yǎng)皿中浸泡、清洗30 s～40 s后取出，在含有青、鏈霉素的無Ca2＋、Mg2＋的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中清洗3遍后，將耳皮膚組織移入35 mm的玻璃培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 小鼠耳皮膚成纖維細胞的原代培養(yǎng) 將耳皮膚組織塊剪碎，用無Ca2＋、Mg2＋的PBS清洗，棄去上層懸浮組織，加入5 mL 2.5 g／L胰蛋白酶－EDTA，置于37℃的培養(yǎng)箱中消化30 min后取出，加5 mL含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，移液槍反復吹打，經(jīng)200目不銹鋼細胞篩過濾，取濾液于10 mL離心管中，以1 000 r／min離心10 min，棄上清液，再加無Ca2＋、Mg2＋的 PBS清洗、搖勻，重復離心（1 000 r／min，10 min），棄上清液。調(diào)整細胞密度至1×105個／mL，接種于無菌的12.5 cm2培養(yǎng)瓶中，體積分數(shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中，37℃并且飽和濕度條件下進行原代培養(yǎng)。

1.2.3 小鼠耳皮膚成纖維細胞的傳代培養(yǎng) 當小鼠耳皮膚成纖維細胞貼壁生長鋪滿瓶底，達到80%～90%時，采用1.25 g／L胰蛋白酶－EDTA消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.4 小鼠耳皮膚成纖維細胞的凍存 當培養(yǎng)的第3代小鼠耳皮膚成纖維細胞貼壁生長鋪滿瓶底，達到80%以上時，棄去培養(yǎng)液，無 Ca2＋、Mg2＋的PBS清洗兩遍，加入1.25g／L胰蛋白酶－EDTA消化至大部分細胞變圓后，采用含血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，將細胞吹散后經(jīng)1000 r／min離心10 min，棄去上清液，收集細胞，加入DMEM培養(yǎng)液，重復離心，將冷凍保護液重新懸浮細胞加入2 mL細胞凍存管中并標記試驗編號和日期等。

以100 mL／L FBS ＋ 100 mL／L DMSO ＋DMEM 或 100 mL／L FBS ＋ 100 mL／L GL ＋DMEM作為冷凍保護液，分別采用4種冷凍方法對體外培養(yǎng)第3代小鼠耳皮膚成纖維細胞進行冷凍保存（表1）。

表1 小鼠耳皮膚成纖維細胞的冷凍方法設(shè)計Table1 Cryopreservation methods of mouse ear skin fibroblasts

1.2.5 細胞的復蘇 細胞經(jīng)液氮凍存1個月后，從液氮罐中取出凍存管，檢查是否有蓋子松動（若蓋子松動則棄去此樣品），迅速投入37℃恒溫水浴鍋中，并不斷搖動凍存管使其迅速解凍。待完全溶化后取出凍存管，用750 mL／L酒精消毒。以完全培養(yǎng)液稀釋，將溶液轉(zhuǎn)至10 mL離心管內(nèi)，以1 000 r／min離心10 min，棄去上清液（冷凍保護液）以減少冷凍保護劑對細胞的毒性作用。

1.2.6 細胞計數(shù)和細胞存活率的統(tǒng)計 將小鼠耳皮膚成纖維細胞懸液與4 g／L臺盼藍染液按4∶1的比例混勻，靜置2 min，采用血球計數(shù)板統(tǒng)計細胞密度和細胞存活率，其中死細胞被染成藍色，而活細胞不著色。

細胞密度（細胞數(shù)／mL）＝（四大格的細胞數(shù)／4）×10 000×稀釋倍數(shù)

細胞存活率（%）＝［（細胞總數(shù)－死細胞數(shù)）／細胞總數(shù)］×100%

1.2.7 細胞貼壁率的統(tǒng)計 將解凍復蘇后的小鼠耳皮膚成纖維懸液進行細胞計數(shù)，計為細胞濃度1，然后將細胞接種到12.5 m2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，48 h后吸棄培養(yǎng)液，無Ca2＋、Mg2＋的PBS清洗2遍～3遍后，采用1.25 g／L胰蛋白酶－EDTA消化已貼壁細胞，統(tǒng)計細胞密度計為細胞濃度2。

細胞貼壁率（%）＝（細胞濃度2／細胞濃度1）×100%。

細胞貼壁率＝（48 h后貼壁細胞濃度／接種細胞濃度）×100%

1.2.8 小鼠耳皮膚成纖維細胞的生長曲線繪制采用篩選所得適宜冷凍方法和冷凍保護劑進行小鼠耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存。調(diào)整解凍復蘇后的第3代小鼠耳皮膚成纖維細胞接種濃度為5×104個／mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔滴加0.4 mL，即每孔的最初細胞總數(shù)約為2×104個，每2 d換液1次。從接種時間算起，每隔24 h用1.25 g／L胰蛋白酶－EDTA消化3孔細胞，用血球計數(shù)板分別進行計數(shù)，求其平均值，連續(xù)進行7 d。以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞總數(shù)為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.9 統(tǒng)計學分析 試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS 13.0軟件對小鼠耳皮膚成纖維細胞的存活率和貼壁率進行單因素方差分析（One－Way－ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞冷凍－解凍后細胞存活情況的影響

不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞解凍復蘇后細胞存活情況的影響見表2。由表2可知，以100 mL／L DMSO作為冷凍保護劑進行小鼠耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存時，方法3處理組的解凍復蘇后細胞存活率高于方法2（P＞0.05），極顯著高于方法1（P＜0.01）和方法4處理組（P＜0.01）。以100 mL／L GL作為冷凍保護劑進行小鼠耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存時，方法3的解凍復蘇后細胞存活率高于方法2（P＞0.05），并分別極顯著高于方法1（P＜0.01）和方法4處理組（P＜0.01）。在相同方法的情況下，100 mL／L DMSO作為冷凍保護劑處理組的解凍復蘇后的細胞存活率均分別高于100 mL／L GL處理組，并且在方法2中表現(xiàn)出極顯著的差異（P＜0.01）。因此，宜選用100 mL／L DMSO作為冷凍保護劑，采用方法3進行冷凍保存可以獲得較高的小鼠耳皮膚成纖維細胞解凍復蘇后的細胞存活率。

表2 不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞冷凍－解凍后細胞存活率（%）的影響Table2 Effect of different cryopreservation methods and cryoprotectants on survival rate（%）of mouse ear skin fibroblasts after being thawed

2.2 不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞冷凍－解凍后培養(yǎng)48 h細胞貼壁情況的影響

不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞冷凍－解凍后培養(yǎng)48 h細胞貼壁情況的影響見表3。

由表3可知，以100 mL／L DMSO作為冷凍保護劑進行小鼠耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存時，方法3處理組的解凍復蘇后培養(yǎng)48 h細胞貼壁率與方法2無顯著性差異（P＞0.05），但極顯著高于方法1和方法4處理組（P＜0.01）。以100 mL／L GL作為冷凍保護劑時，方法3處理組的解凍復蘇后培養(yǎng)48 h細胞貼壁率極顯著地高于其他各處理組（P＜0.01）。就同一種冷凍方法而言，100 mL／L DMSO作為冷凍劑處理組的解凍復蘇后培養(yǎng)48 h細胞貼壁率均高于100 mL／L GL處理組，且在方法2中表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），在方法3中表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。因此，宜選用100 mL／L DMSO作為冷凍保護劑，采用方法3進行冷凍保存可以獲得較高的小鼠耳皮膚成纖維細胞解凍復蘇后培養(yǎng)48 h細胞貼壁率。

表3 不同冷凍保存方法和冷凍保護劑對小鼠耳皮膚成纖維細胞解凍復蘇后培養(yǎng)48 h細胞貼壁率（%）的影響Table3 Effect of different cryopreservation methods and cryoprotectants on adhesive rate（%）of mouse ear skin fibroblasts after being thawed and cultured for 48 h

2.3 小鼠耳皮膚成纖維細胞的生長曲線

小鼠耳皮膚成纖維細胞的生長曲線見圖1。圖1表明，培養(yǎng)1 d～2 d為小鼠耳皮膚成纖維細胞培養(yǎng)的潛伏期，3 d～4 d為對數(shù)生長期，第5 d后細胞數(shù)量開始減少，為平臺期和衰退期。冷凍解凍后的細胞呈現(xiàn)正常的分裂增殖生長模式，這表明以100 mL／L DMSO作為冷凍劑，采用方法3進行冷凍保存對小鼠耳皮膚成纖維細胞后續(xù)生長影響較小。

圖1 小鼠耳皮膚成纖維細胞的生長曲線Fig.1 The growth curve of the mouse ear skin fibroblasts

3 討論

3.1 不同冷凍保護劑對耳皮膚成纖維細胞冷凍效果的影響

冷凍保護劑是指通過稀釋溶液中的溶質(zhì)濃度，減少冷凍和解凍過程中對細胞造成的損傷（如細胞內(nèi)結(jié)冰、脫水、溶質(zhì)濃度提高和蛋白質(zhì)變性及骨架結(jié)構(gòu)的損傷等）的某一類化合物［1］。50多年前，英國的一個研究小組在一次試驗中偶然發(fā)現(xiàn)了對精子和人紅細胞的有效冷凍保護劑之后［2］，相繼出現(xiàn)了二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（ethylene glycol，EG）和甘油（GL）等其他冷凍保護劑，其最重要的特點是能夠穩(wěn)定滲入細胞，且在濃度為1 mol／L左右時對細胞相對無毒，其保護功能的基本機制是在降溫過程中透過細胞膜進入細胞內(nèi)，使得細胞皺縮程度降低［3］。另外，葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、聚乙二醇以及蔗糖等非滲透性冷凍保護劑的功能在于加快溶液的玻璃化，穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細胞膜，以及防止進一步的結(jié)冰［4］。

目前多采用DMSO、GL或EG等作為細胞凍存的冷凍保護劑。這幾種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞膜，降低冰點以減少冷凍保護劑對細胞的毒性作用。王紅梅等［5］采用DMSO作為冷凍保護劑的效果好于EG，使用DMSO細胞存活率達到70%～90%，而EG只有30%～50%。任芳麗等［6］研究表明200 mL／L DMSO保護液對牛皮膚成纖維細胞的凍存保護效果好于其它濃度的DMSO、EG及GL，復蘇后平均貼壁率達到87.9%。趙雪萍等［7］比較了DMSO、GL和EG 3種冷凍保護劑對麋鹿耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存效果，結(jié)果表明添加100 mL／L DMSO的凍存液效果最佳，解凍后細胞貼壁率達87.78%。王亮等［8］采用200 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO＋70%細胞懸液對奶牛耳皮膚成纖維細胞進行凍存，復蘇后細胞存活率達到86.68%，培養(yǎng)48 h貼壁率為86.40%。周向梅等［9］以100 mL／L DMSO＋900 mL／L FBS為冷凍保護液冷凍保存第3代矮馬耳緣組織成纖維細胞，復蘇后存活率達92.2%。本試驗以100 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO＋ DMEM 作為冷凍保護液，得到最高的細胞存活率為84.88%，培養(yǎng)48h后的細胞貼壁率為 81.00%；以 100 mL／L FBS＋100 mL／L GL＋DMEM作為冷凍保護液，得到最高的細胞存活率為71.65%，培養(yǎng)48 h后的細胞貼壁率為67.03%。較 100 mL／L GL 相 比，100 mL／L DMSO作為冷凍保護劑效果更佳。但是，由于DMSO、GL和EG是一種有毒的化學物質(zhì)，高濃度下作為凍存保護劑也會對細胞造成損傷，將DMSO提前4℃預冷，有利于降低其對細胞的毒性損害［8］。近年來，一些學者研發(fā)出了新型冷凍保護劑，如抗凍蛋白、乙酞胺、海藻糖、植物類抗凍因子等，這些凍存保護劑在低濃度時對細胞有較好的保護效果。

3.2 不同冷凍保存方法對耳皮膚成纖維細胞冷凍效果的影響

細胞冷凍效果受冷凍速率的影響。常規(guī)冷凍法下，若冷凍速率過快，則易形成胞內(nèi)冰晶，這些細胞內(nèi)冰晶在溫度回升過程中會發(fā)生再結(jié)晶而導致細胞受損；如果降溫速率過慢，則細胞收縮過劇烈，并且細胞處在高濃度溶液中也會引起損傷。本試驗中，采用方法3的效果好于其他幾種方法，這可能與小鼠耳皮膚成纖維細胞懸掛在液氮罐內(nèi)的氣態(tài)氮中4 h，使細胞內(nèi)水分充分外滲又不完全脫干，從而減少冰晶形成，降低對細胞的損傷有關(guān)。氣態(tài)氮處理的方法在其他動物細胞冷凍上也有使用，如陸會寧等［10］將凍存管在4℃冰箱中放置30 min～1 h后，在液氮面過夜，次日放入液氮罐中保存，解凍后貴德黑裘皮羊耳成纖維細胞存活力為93.16%，24 h后的貼壁率為85%；趙雪萍等［7］將凍存管在4℃放置30 min，移入－20℃放置1.5 h，再在液氮面上方懸吊7 h～8 h后投入液氮，解凍后麋鹿耳皮膚成纖維細胞貼壁率達87.78%。本試驗中，方法1和方法2雖經(jīng)過預冷平衡，控制了降溫速率，但可能其速率仍會導致細胞內(nèi)冰晶形成，從而使細胞復蘇后存活率和貼壁率低于方法3。陳華等［11］比較了3種冷凍方法對波爾山羊成纖維細胞凍存效果的影響，結(jié)果表明方法3（4℃平衡1 h、－80℃過夜，然后投入液氮）冷凍細胞解凍后得細胞貼壁率為61.6%，明顯優(yōu)于方法1（4℃平衡1 h，－20℃冷凍6 h，直接投入液氮）和方法2（4℃平衡1 h，－20℃冷凍6 h，－80℃過夜，直接投入液氮），并認為－20℃不利于細胞保存，推測可能是由于－20℃左右是細胞冷藏的危險區(qū)域，且易發(fā)生低溫損傷，建議細胞在此階段不宜停留時間過長。許丹娜等［12］采用將凍存管在4℃下平衡30 min后置于－80℃超低溫冰箱過夜，第2天投入液氮的方法對食蟹猴成纖維細胞進行凍存，解凍后第7代細胞的存活率達95.15%。關(guān)偉軍等［13］將凍存管放入裝有異丙醇的冷凍盒中，于－70℃冰箱中過夜，第2天放入液氮罐中保存，小尾寒羊耳組織成纖維細胞復蘇后的存活率達94.7%。馬月輝等［14］采用同樣的方法冷凍保存矮馬耳緣組織成纖維細胞，復蘇后存活率達92.2%。但是，李忠秋等［15］采用4℃平衡40 min，在－20℃冷凍2 h，在－70℃過夜，次日投入液氮保存種公牛耳組織成纖維細胞，細胞復蘇后的存活率也高達93.7%。因此，－20℃冷凍處理對細胞是否具有很大的損傷作用還有待進一步的研究。另外，本試驗中，采用方法4得到的細胞存活率、貼壁率顯著偏低，可能原因是降溫速率過快，形成胞內(nèi)冰晶，這些細胞內(nèi)冰晶在溫度回升過程中會發(fā)生再結(jié)晶而導致細胞受損。

因此，宜采用100 mL／L DMSO冷凍保護劑，經(jīng)4℃預冷平衡0.5 h，接著懸掛在液氮罐內(nèi)的氣態(tài)氮中4 h，然后沉入液氮的方法凍存小鼠耳皮膚成纖維細胞。

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