劉昕 ， 胡會(huì)玲 ， 張敏愛 ， 薛幗珍 ， 閆曉睿 ， 張希春 ， 劉計(jì)權(quán)

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030600；

2.太原海關(guān)技術(shù)中心，太原 030021

腸道菌群是一個(gè)龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，其所含細(xì)菌種類繁多，可分為有益菌、有害菌和中性菌3大類［1］。腸道菌群的生態(tài)平衡對(duì)于維持人體代謝、發(fā)育、免疫、感染預(yù)防及治療等正常生理功能發(fā)揮著極其重要的作用，而這種正常的生態(tài)平衡一旦被打破，則會(huì)引起肥胖、糖尿病、肝病、免疫性疾病、精神疾病、慢性腎病等多種疾病的發(fā)生［2］。腸道菌群與人類的健康密切相關(guān)，目前已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。新鮮糞樣經(jīng)腸道排出體外，因其具有取樣方便、無損傷性等特點(diǎn)，常被作為腸道菌群研究的取樣來源［3］。

高通量測(cè)序技術(shù)因其測(cè)序快速、數(shù)據(jù)量大、能夠較為全面地反應(yīng)微生物群落結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于腸道菌群的研究［4］。同時(shí)，DNA樣品濃度、純度和污染也是影響高通量測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確度的重要因素。新鮮糞樣來源于宿主腸道，除了攜帶宿主的腸道微生物群，同時(shí)還包含有大量的食物殘?jiān)?、蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、消化酶等多種雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能會(huì)引起腸道菌群DNA發(fā)生降解、增加DNA被污染的風(fēng)險(xiǎn)、干擾PCR擴(kuò)增和檢測(cè)結(jié)果等問題，所以對(duì)糞樣進(jìn)行預(yù)處理操作，除去雜質(zhì)，進(jìn)而提高腸道菌群DNA的濃度和純度，是保證高通量測(cè)序結(jié)果的有效手段［5］。已有研究報(bào)道可通過PBS緩沖液［6-7］、生理鹽水［8-9］、濾器過濾［10］、均質(zhì)化［11］等預(yù)處理方法達(dá)到除雜提純的目的，其中PBS緩沖液、生理鹽水預(yù)處理是常用方法，然而關(guān)于不同預(yù)處理對(duì)腸道菌群測(cè)定結(jié)果的影響少有報(bào)道。本文采用試劑盒提取DNA，通過高通量測(cè)序?qū)υ技S樣、PBS處理糞樣和生理鹽水處理糞樣進(jìn)行比較分析，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡昆明種小鼠10只，體質(zhì)量22～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)期間自由采光，給予充足的食物和水。

1.1.2試劑 胃蛋白酶購自Sigma化工有限公司；PBS緩沖液和生理鹽水購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DNA提取試劑盒和QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit（5）購自德國QIAGEN公司；Qubit DNA檢測(cè)試劑盒購自Life Technologies；ExTaq高保真酶購自日本Takara公司。

1.1.3儀器 渦旋混合器購自上海第一醫(yī)學(xué)儀器廠；臺(tái)式高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；凈化工作臺(tái)和立式壓力蒸汽滅菌鍋購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；厭氧培養(yǎng)箱購自上海容威儀器設(shè)備有限公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司；電泳儀和凝膠成像儀購自Tanon公司；-80 ℃超低溫冰箱購自美國Thermo Fisher Revco公司；高通量核酸純化儀購自QIAGEN公司；高通量測(cè)序儀購自美國Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1糞樣采集及預(yù)處理 將實(shí)驗(yàn)小鼠分別單獨(dú)放入滅菌的鼠籠中，用一次性無菌鑷子，收集每個(gè)小鼠新鮮糞樣2～3粒置于同一無菌離心管中，混勻。提取DNA之前，將糞樣分為3組，在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)迅速進(jìn)行如下處理。①原始糞樣組（Y）：取新鮮糞樣1 g，裝入15 mL無菌離心管中，保存于-80 ℃冰箱。②生理鹽水處理組（S）：參照Garcia等［8］方法，向裝有1 g新鮮糞樣的50 mL離心管中加入20 mL生理鹽水，用渦旋混勻儀搖動(dòng)3 min后，3 000 r·min-1離心3次，每次3 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱。③PBS處理組（P）：處理液為PBS緩沖液，其余操作同生理鹽水處理組。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增和16S rDNA測(cè)序 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序均由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。根據(jù)提取試劑盒所述方法提取DNA，針對(duì)V3～V4區(qū)域設(shè)計(jì)帶Barcode的 特 異引物343F（5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［12］，通過Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3數(shù)據(jù)分析方法 使用Trimmomatic（version 0.35）［13］軟件、Flash（version 1.2.11）［14］軟件、QIIME中的split-libraries（version 1.8.0）［15］軟件、UCHIME（version 2.4.2）［16］軟件進(jìn)行微生物組學(xué)數(shù)據(jù)分析，使用QIIIME2軟件進(jìn)行多樣性分析，使用SPSS（version 26.0）進(jìn)行顯著性分析，使用Metabo Analyst進(jìn)行PCA分析，QIIIME2軟件在門、綱、科、屬水平下繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控

2.1.1測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì) 表1為3組9個(gè)樣本16S rDNA V3～V4區(qū)的測(cè)序結(jié)果。由表1可知，質(zhì)控之后的Clean tags數(shù)據(jù)量分布在69 909～77 752之間，Clean tags去除嵌合體后得到的Valid tags數(shù)據(jù)量分布在56 015～65 796之間，Valid tags平均長度分布在412.34～421.21 bp，各樣本OTUs分布在351～670之間。

表1 3組9個(gè)樣本的OTUs分析Table 1 OTUs analysis of 9 samples in 3 groups

S組3個(gè)樣本有194 649條序列及1 987個(gè)OTUs；P組3個(gè)樣本有192 179條序列及1 092個(gè)OTUs；Y組3個(gè)樣本有186 241條序列及1 302個(gè)OTUs。

2.1.2Specaccum物種累積曲線 圖1結(jié)果顯示，隨著樣本量由小變大，曲線逐漸趨于平緩；當(dāng)樣本量達(dá)到8時(shí)，此時(shí)群落中的OTUs總數(shù)不再增加，表明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度足夠大，可以反映絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

圖1 物種累積曲線圖Fig. 1 Species accumulation plot

2.1.3Rank abundance分析 曲線越寬表明物種的組成越豐富，曲線趨勢(shì)越平緩表明物種組成的均勻程度越高。圖2中Rank-abundance分析結(jié)果表明，S組曲線寬度最大，說明S組小鼠糞樣微生物豐度最高，而Y組和P組都有所降低；隨著OTU等級(jí)增加，S組、Y組和P組曲線最終均趨于平緩，表明3組糞樣菌群物種分布都較均勻，以S組物種分布的均勻度最高。

圖2 等級(jí)分度曲線Fig. 2 Grade classification curve

2.1.4韋恩圖 圖3中心數(shù)字代表所有樣本共有的OTUs，花瓣上的數(shù)字代表各個(gè)樣本總OTUs減去共有OTUs的數(shù)目。由圖3可知，9個(gè)樣本共有188個(gè)OTUs，S組3個(gè)特異性的OTUs數(shù)目均高于P組和Y組，Y組3個(gè)特異性的OTUs數(shù)目均高于P組，表明S組的微生物多樣性和豐富度最高，Y組次之，P組最低。

圖3 Core-Pan圖Fig. 3 Core-Pan diagram

2.2 不同預(yù)處理對(duì)糞樣菌群多樣性的影響

2.2.1AIpha菌群多樣性指數(shù)分析 由表2可知，3組樣本的Goods coverage均達(dá)到了0. 99以上，且3組之間無顯著差異，表明本次測(cè)序的結(jié)果能真實(shí)反映樣本的微生物分布情況。S組的Chao l、Observed-species、Shannon、Simpson指數(shù)均顯著高于P組和Y組，Y組的Chao l、Observed-species、Shannon、Simpson多樣性指數(shù)均顯著高于P組，表明S組樣本微生物群落的豐度和多樣性最高，Y組次之，P組最低。

表2 不同預(yù)處理組糞樣菌群的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of faecal flora in different pretreatment groups

2.2.2PCA分析 圖4結(jié)果表明，第一、第二主坐標(biāo)分別解釋了菌群結(jié)構(gòu)總變異的50.21%、12.27%；聚類現(xiàn)象表明，各組內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)相似，P組與Y組距離較近，說明P組與Y組菌群結(jié)構(gòu)相近；與P組相比，Y組距離S組更近，說明Y組與S組菌群結(jié)構(gòu)更相近。

圖4 PCA（2D）分析Fig. 4 PCA(2D) analysis

2.2.3樹狀圖聚類分析 采取隨機(jī)重復(fù)抽樣算法，對(duì)UPGMA的可靠性進(jìn)行分析，構(gòu)建了樣本聚類樹狀圖。由圖5可以看出，3組9個(gè)樣本共聚為2大類，S組3個(gè)樣本單獨(dú)為一類，Y組合P組的6個(gè)樣本聚為一類。S組與Y組的分支距離和可靠性比S組與P組分支距離近且可靠性高；Y組部分樣本與P組聚為另一類，但可靠性較低，P組與Y組部分樣本中的菌群相似，但相似程度較低。

圖5 Jackknifed-UPGMA樣本相似性聚類圖Fig.5 Jackknifed-UPGMA sample similarity cluster graph

2.3 不同預(yù)處理對(duì)糞樣菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1在門分類水平上的差異分析 在門水平上，S組、P組和Y組分別檢出14、11、12個(gè)門，3組共有的門為11個(gè)，圖6和表3列出了3組糞樣豐度排在前5的共有門。擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、和變形菌門（Proteobacteria）為3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，放線菌門（Actinobacteria）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）含量較少。

表3 在門水平上不同糞樣處理組的相對(duì)豐度（Xˉ±S）Table 3 Relative abundance of fecal samples in different treatment groups at phylum level（Xˉ±S）

圖6 在門水平上不同糞樣處理組的群落組成分布Fig. 6 Community composition distribution in different fecal treatment groups at phylum level

擬桿菌門（Bacteroidetes）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）的相對(duì)豐度在3組糞樣之間均無顯著差異（P＞0.05）；厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度在3組糞樣之間差異顯著（P＜0.05），以S組最高，其次為Y組、P組；P組和Y組中變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度高于S組（P＜0.05），但P組、Y組之間無顯著差異（P＞0.05）；P組中放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度顯著高于S組（P＜0.05），S組與Y組之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2在綱分類水平上的差異分析 在綱水平上，S組、P組和Y組分別檢出24、21、21個(gè)綱，3組共有的綱為20個(gè)，圖7和表4列出了3組糞樣豐度排在前5的共有綱，包括擬桿菌綱（Bacteroidia）、梭菌綱（Clostridia）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）、厚壁菌綱（Negativicutes）。

圖7 在綱水平上不同糞樣處理組的群落組成分布Fig. 7 Community composition distribution in different fecal treatment groups at class level

表4 在綱水平上不同糞樣處理組的相對(duì)豐度（±S）Table 4 Relative abundance of fecal samples in different treatment groups at class level（Xˉ±S）

表4 在綱水平上不同糞樣處理組的相對(duì)豐度（±S）Table 4 Relative abundance of fecal samples in different treatment groups at class level（Xˉ±S）

注：同一行不同組別標(biāo)的不同字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

?

擬桿菌綱（Bacteroidia）的相對(duì)豐度在3組之間無顯著差異（P＞0.05）；S組中梭菌綱（Clostridia）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的相對(duì)豐度顯著高于P組和Y組（P＜0.05），但P組和Y組之間無顯著差異（P＞0.05）；Y組中丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）的相對(duì)豐度顯著高于S組和P組（P＜0.05），S組和P組之間無顯著差異（P＞0.05）；厚壁菌綱（Negativicutes）的相對(duì)豐度在3組之間差異顯著（P＜0.05），以S組最高，其次為P組、Y組。

2.3.3在科分類水平上的差異分析 在科水平上，S組、P組和Y組分別檢出62、55、59個(gè)科，3組共有26個(gè)科，圖8和表5列出了3組糞樣豐度排在前7的共有科，包括普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、伯克霍爾德科（Burkholderiaceae）、擬桿菌科（Bacteroidiaceae）、丹毒桿菌科（Erysipelotrichaece）。

表5 在科水平上不同糞樣處理組的相對(duì)豐度（Xˉ±S）Table 5 Relative abundance of fecal samples in different treatment groups at family level（Xˉ±S）

圖8 在科水平上不同糞樣處理組的群落組成分布Fig. 8 Community composition distribution in different fecal treatment groups at family level

普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的相對(duì)豐度在3組之間無顯著差異（P＞0.05）；瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和擬桿菌科（Bacteroidiaceae）的相對(duì)豐度在3組之間差異顯著（P＜0.05），以S組最高；伯克霍爾德科（Burkholderiaceae）和丹毒桿菌科（Erysipelotrichaece）的相對(duì)豐度在S組和Y之間組無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于P組（P＜0.05）；腸桿菌科（Enterobacteriaceae）在P、Y兩組的相對(duì)豐度顯著高于S組（P＜0.05）；毛螺菌科（Lachnospiraceae）在S組的相對(duì)豐度顯著高于P、Y組（P＜0.05）。

2.3.4在屬分類水平上的差異分析 在屬水平上，S組、P組和Y組分別檢出147、126、137個(gè)屬，3組共有117個(gè)屬，圖9和表6列出了3組糞樣豐度排在前10的共有屬，包括普雷沃氏菌屬9（Prevotella_9）、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella）、大腸桿菌-志賀氏菌屬（Escherichia_Shigella）、羅氏菌屬（Roseburia）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、副薩特氏菌屬（Parasutterella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、鏈狀桿菌屬（Catenibacterium）、毛螺旋菌科UCG-004菌屬（Lachnospiraceae_UCG-004）、乳梭菌屬（Lachnoclostridium）。

圖9 在屬水平上不同糞樣處理組的群落組成分布Fig. 9 Community composition distribution in different fecal treatment groups at genus level

表6 在屬水平上不同糞樣處理組的相對(duì)豐度（Xˉ±S）Table 6 Relative abundance of fecal samples in different treatment groups at genus level（Xˉ±S）

雷沃氏菌屬9（Prevotella_9）的相對(duì)豐度在3組之間無顯著差異（P＞0.05）；P組和Y組的克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella）、毛螺旋菌科UCG-004菌屬（Lachnospiraceae_UCG-004）、乳梭菌屬（Lachnoclostridium）的相對(duì)豐度無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于S組（P＜0.05）；S組羅氏菌屬（Roseburia）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）的相對(duì)豐度顯著高于P組和Y組（P＜0.05），但P組和Y組之間差異不顯著（P＞0.05）；大腸桿菌-志賀氏菌（Escherichia_Shigella）的相對(duì)豐度在3組之間差異顯著（P＜0.05），以P組最高，其次為Y組、S組。

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已被廣泛應(yīng)用于腸道菌群多樣性、豐度及菌群組成的研究中。樊英等［17］利用高通量測(cè)序分析了大瀧六線魚表皮粘液及腸道內(nèi)容物微生物多樣性；劉銘等［18］應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)我國東海帶魚腸道菌群進(jìn)行了研究；申進(jìn)增［19］研究了當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腸道菌群的影響。腸道菌群的狀態(tài)可以通過糞樣菌群的變化反映出來［20］，但糞樣并不能真實(shí)代表腸道菌群的組成，由于受限于目前沒有更好的采樣方式，所以在腸道菌群的研究中，一般以新鮮糞樣作為取樣來源。糞樣中除攜帶腸道細(xì)菌外，還含有大量的腐殖質(zhì)、腸道內(nèi)壁脫落細(xì)胞及碎片、各種有機(jī)物和無機(jī)物等［21］，所以對(duì)糞樣進(jìn)行預(yù)處理具有必要性。董鵬飛等［9］研究發(fā)現(xiàn)，用生理鹽水處理可以有效增加腸道菌群DNA的純度和濃度，提高腸道微生物DNA的提取質(zhì)量。張雪雁等［22］采用PBS緩沖液處理糞樣，可以在一定程度上去除糞樣中的雜質(zhì)和抑制物。曹冉冉等［23］發(fā)現(xiàn)生理鹽水和PBS緩沖液預(yù)處理是目前提取糞樣核酸常用的方法。

本文采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)比分析原始糞樣、生理鹽水預(yù)處理糞樣和PBS緩沖液預(yù)處理糞樣中菌群的差異性，發(fā)現(xiàn)糞樣經(jīng)過生理鹽水處理后，不僅可以去除雜質(zhì)，同時(shí)有利于保持糞樣微生物的多樣性和豐富度；PBS緩沖液雖然可以去除糞樣雜質(zhì)，但在一定程度上降低了糞樣微生物的多樣性和豐度。高通量測(cè)序中，采用生理鹽水對(duì)糞樣進(jìn)行預(yù)處理，能夠在一定程度上提高糞樣中菌群檢測(cè)的準(zhǔn)確性。原始糞樣由于帶有大量雜質(zhì)可能會(huì)影響某些菌群的檢出，不同溶液預(yù)處理可能會(huì)造成某些菌群的損失，不同處理方式對(duì)不同菌群的影響也不完全一樣，其具體影響原因有待于進(jìn)一步研究。

研究還發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門均為原始糞樣組、生理鹽水處理組和PBS緩沖液處理組排在前3位的優(yōu)勢(shì)菌門，這與文獻(xiàn)［24-25］報(bào)道的研究結(jié)果相一致，3組糞樣均能最大程度上保留優(yōu)勢(shì)菌門。厚壁菌門是腸道內(nèi)最為優(yōu)勢(shì)的一大類細(xì)菌，這一類細(xì)菌屬于革蘭陽性厭氧菌［19］，很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，用以抵抗脫水和極端環(huán)境，動(dòng)物腸道中的厚壁菌屬于化能營養(yǎng)型細(xì)菌，能幫助動(dòng)物從食物中獲取更多的能量［26］。放線菌是革蘭陽性厭氧菌，可增加腸道內(nèi)抗生素的產(chǎn)量，進(jìn)而破壞腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，加劇相關(guān)疾病的進(jìn)展［27］，3組糞樣均檢出了放線菌門。

瘤胃球菌科屬于厚壁菌門，是胃腸道中分解纖維素和發(fā)酵抗性淀粉的主要菌屬［28］，瘤胃球菌具有碳水化合物降解活性，可通過分泌纖維素酶、半纖維素酶等降解纖維物質(zhì)，并有助于細(xì)胞吸收糖分，為宿主提供所需營養(yǎng)物質(zhì)［29］；擬桿菌能夠參與碳水化合物發(fā)酵、多糖代謝、膽汁酸和類膽固醇代謝、抑制機(jī)體炎性反應(yīng)、影響宿主免疫系統(tǒng)、維持腸道正常生理等諸多功能，對(duì)宿主健康具有重要影響［30］；伯克霍爾德菌科涵蓋生態(tài)上極其多樣化的微生物，包括真正的環(huán)境腐生生物、植物病原體、條件致病菌，多數(shù)為人類和動(dòng)物的主要致病菌［31］。本次研究中，瘤胃球菌科、擬桿菌科和伯克霍爾德科作為排在前7的共有科在3組糞樣均被檢出。

普雷沃氏菌屬能促進(jìn)腸道消化碳水化合物和膳食纖維，從而有利于維持腸道菌群穩(wěn)定，增強(qiáng)免疫功能［32］；糞桿菌屬、毛螺旋菌科UCG-004菌屬是腸道中的有益菌屬，與短鏈脂肪酸產(chǎn)生相關(guān)［33］；羅氏菌屬為腸道中產(chǎn)生丁酸的優(yōu)勢(shì)菌［34］；擬桿菌屬菌群可在人體腸道內(nèi)產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸對(duì)維持機(jī)體功能具有重要作用；乳梭菌屬在腸道中多數(shù)為非致病菌，少數(shù)為致病菌；此外，克雷伯氏菌、大腸桿菌-志賀氏菌均來自腸桿菌科，屬于條件致病菌［35］。以上菌屬作為3組糞樣豐度排在前10的共有屬均被檢出。

腸道菌群是一個(gè)極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，包括許多生物因子和非生物因子，不同的取樣方法、預(yù)處理方式、DNA提取方式、測(cè)序方式等均會(huì)對(duì)腸道菌群的研究結(jié)果產(chǎn)生影響，同一處理方式對(duì)不同腸道微生物的的影響也可能不同。此外，小鼠物種、個(gè)體、周齡等差異均會(huì)對(duì)腸道菌群研究結(jié)果產(chǎn)生影響，今后應(yīng)對(duì)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的可能因素進(jìn)行系統(tǒng)分析。