劉曉東 任偉嘉 何 淼

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

玫瑰(Rosa rugosa Thumb.)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬直立叢生落葉灌木，其品種繁多，花色豐富，香氣濃郁，不僅是很好的觀賞花卉和庭院綠化植物，也是珍貴的中藥材和香料工業(yè)、食品工業(yè)的重要原料。玫瑰的抗逆性很強(qiáng)，耐干旱瘠薄、寒冷、鹽堿，是薔薇屬觀賞植物育種的重要資源［1－2］。在寒冷的黑龍江地區(qū)，由于溫度極低，適于園林綠化及生產(chǎn)的樹(shù)種較少。研究以哈爾濱地區(qū)引種的苦水玫瑰(Rosa rugosa‘kushui’)、冷香玫瑰(Rosa rugosa‘lengxiang’)為試材，通過(guò)不同低溫脅迫處理研究分析2個(gè)品種的低溫脅迫的半致死溫度、低溫脅迫與生理指標(biāo)的相關(guān)性，為黑龍江地區(qū)觀花灌木的引種和園林應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

2011年3月份分別從遼寧、甘肅引進(jìn)冷香玫瑰(Rosa rugosa‘lengxiang’)、苦水玫瑰(Rosa rugosa‘kushui’)苗木，并種植于東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃。試驗(yàn)于2011年11月下旬在東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以田間1年生離體休眠枝條為試驗(yàn)材料進(jìn)行各生理指標(biāo)的測(cè)定。

低溫脅迫處理與恢復(fù)試驗(yàn)方法:選取長(zhǎng)勢(shì)一致、整齊均勻、粗度相近的成熟枝條，剪留約20 cm，蒸餾水清洗干凈后用石蠟封口，并裝入聚乙烯袋中貼好標(biāo)簽，全部置于超低溫冰箱中。處理溫度為－25、－30、－35、－38(哈爾濱地區(qū)極限溫度)、－40℃，以2011年哈爾濱室外田間溫度(－15℃)為對(duì)照，參考李合生［3］的研究方法。低溫處理以3℃·h－1的溫差遞降，每個(gè)溫度梯度處理6 h。將低溫處理的枝條置于冰箱內(nèi)0～4℃解凍9 h，室溫恢復(fù)后，進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以不做人工低溫處理材料(室溫)為對(duì)照。

從不同溫度梯度處理的枝條中各取5個(gè)用于恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)。在25℃室溫條件下進(jìn)行水中培養(yǎng)，每天換1次水，20 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽枝數(shù)和累計(jì)發(fā)芽數(shù)。待發(fā)芽數(shù)穩(wěn)定之后，計(jì)算存活枝條的萌發(fā)率。

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定:將處理后的枝條用蒸餾水沖洗干凈，并用潔凈的濾紙吸干。然后，剪成2 mm大小(避開(kāi)芽眼)混均，用分析天平稱0.2 g后置于小燒杯中，加入20 mL去離子水，每個(gè)品種3次重復(fù)。真空抽氣5 min后，室溫下靜止30 min，用電導(dǎo)儀測(cè)定處理溶液電導(dǎo)率。然后再將小燒杯用保鮮膜封口，置于100℃沸水浴中20 min后去除封口，室溫下靜止30 min后測(cè)定煮沸電導(dǎo)率，計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率:相對(duì)電導(dǎo)率=(處理電導(dǎo)率(B)/煮沸電導(dǎo)率(C))×100%。并利用電導(dǎo)率logistic方程擬合法，計(jì)算低溫半致死溫度。

不同生理指標(biāo)的測(cè)定:可溶性蛋白、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性等均參照李合生的方法［3］測(cè)定。其中，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法;超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法;游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用茚三酮法;過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在SPSS17.0和EXCEL2007軟件中進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫脅迫對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞膜是低溫作用于細(xì)胞的原初部位，植物在受低溫傷害后膜系統(tǒng)最先受害，細(xì)胞膜透性會(huì)發(fā)生改變，因此與植物抗寒性有密切關(guān)系。早在20世紀(jì)70年代，Lyons就提出細(xì)胞膜是低溫冷害的首要部位，在低溫下植物細(xì)胞膜由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變成凝膠狀態(tài)，膜收縮，以致電導(dǎo)率增大［4－5］。

本試驗(yàn)測(cè)定了低溫脅迫下，2個(gè)品種玫瑰1年生休眠枝條的相對(duì)電導(dǎo)率與溫度的關(guān)系，如表1所示。2個(gè)品種相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)基本一致，均隨著溫度的降低呈上升趨勢(shì)。在CK(－15℃)到－25℃的低溫脅迫下，2個(gè)品種玫瑰相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)相對(duì)較平緩，到－40℃時(shí)均達(dá)最高值，即42.62%和42.86%。各品種相對(duì)電導(dǎo)率迅速增大，表明2個(gè)品種膜系統(tǒng)受到的傷害加劇。相同溫度條件下，苦水玫瑰的相對(duì)電導(dǎo)率基本高于冷香玫瑰，可見(jiàn)苦水玫瑰對(duì)低溫脅迫敏感度高，說(shuō)明冷香玫瑰對(duì)低溫的適應(yīng)性強(qiáng)于苦水玫瑰。

2.2 不同低溫脅迫下2種玫瑰半致死溫度LT50

低溫脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率與溫度之間關(guān)系呈S形曲線，符合logistic方程，故對(duì)其進(jìn)行回歸分析得到方程y=k/(1+ae－bx)，并具有較好的擬合度。根據(jù)朱根海等［6］的方法，可知求 logistic方程的二階導(dǎo)數(shù)，并令y=0，曲線的拐點(diǎn)x=(lna)/b所得的值即為半致死溫度(LT50)(表2)。

表1 不同低溫脅迫對(duì)不同品種玫瑰相對(duì)電導(dǎo)率的影響

表2 不同低溫脅迫對(duì)2種玫瑰相對(duì)電導(dǎo)率影響的Logistic方程

通過(guò)回歸分析得出，苦水玫瑰的半致死溫度為－43.3℃，冷香玫瑰的半致死溫度為－44.9℃?；貧w方程相關(guān)系數(shù)分別為0.934、0.949，呈極顯著水平，表明這2種玫瑰的相對(duì)電導(dǎo)率值與溫度呈線性相關(guān)，符合logistic方程條件，結(jié)果精確。并客觀地反映了2種玫瑰的抗寒力的大小。

2.3 不同低溫脅迫對(duì)可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

目前在許多植物抗性研究中發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與植物抗寒性之間存在著密切關(guān)系，低溫脅迫引起細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。而可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，有助于提高細(xì)胞內(nèi)的束縛水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低冰點(diǎn)，可以說(shuō)是防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、避免細(xì)胞冰凍死亡的原因之一［7］?？扇苄缘鞍椎挠H水膠體性強(qiáng)，能明顯增強(qiáng)細(xì)胞的持水力，從而提高植物的抗冷性。如表3所示，2個(gè)不同品種玫瑰的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度的變化呈逐漸上升趨勢(shì)。在－38℃時(shí)達(dá)最高峰，此時(shí)，冷香玫瑰的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于苦水玫瑰的，之后呈下降趨勢(shì)。在相同低溫脅迫過(guò)程中，冷香玫瑰的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本略高于苦水玫瑰。

2.4 不同低溫脅迫對(duì)保護(hù)酶活性的影響

植物在低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧會(huì)造成膜脂的過(guò)氧化作用及膜蛋白的破壞，而一些保護(hù)酶類(lèi)，如SOD、POD則可以迅速清除活性氧等毒害物質(zhì)，保護(hù)植物細(xì)胞少受或免受傷害［8］。大量研究表明，低溫脅迫下保護(hù)酶活性與溫度呈正相關(guān)。

表3 不同低溫脅迫對(duì)2種玫瑰各生理生化指標(biāo)的影響

2.4.1 不同低溫脅迫對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是植物體中最重要的清除自由基的酶之一，其主要功能，即清除超氧陰離子自由基使其發(fā)生歧化反應(yīng)［9］。其活性大小可以反映細(xì)胞對(duì)逆境的適應(yīng)能力，間接地說(shuō)明了植物耐寒性的強(qiáng)弱，SOD活性增大說(shuō)明在低溫脅迫下其清除自由基的能力增強(qiáng)［10］。如表3所示，2種玫瑰的超氧化物歧化酶(SOD)活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，在－30℃時(shí)，2種玫瑰SOD活性達(dá)最高值，比對(duì)照值分別增加了70%和87%;在－35℃時(shí)，2種玫瑰SOD活性急劇下降;當(dāng)溫度為－35～－40℃時(shí)，2種玫瑰SOD活性緩慢下降。總體上看，相同低溫脅迫處理下冷香玫瑰的SOD活性大于苦水玫瑰的。

2.4.2 不同低溫脅迫對(duì)過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響

過(guò)氧化物酶(POD)是植物膜脂過(guò)氧化的酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，主要起到酶促降解H2O2的作用，防止膜傷害從而提高植物的抗逆性。POD活性與植物的抗寒力有著密切的關(guān)系，其活性高低可以反映植物抗寒能力的大?。?1］。如表3所示，2種玫瑰過(guò)氧化物酶(POD)活性總體來(lái)看呈先上升后下降再上升再下降的趨勢(shì)。在－30℃時(shí)，2種玫瑰的POD活性達(dá)第一個(gè)高峰，然后緩慢下降;在－38℃時(shí)，2種玫瑰的POD活性達(dá)最高峰，苦水玫瑰POD活性達(dá)375 U·g－1·min－1，冷香玫瑰 POD 活性達(dá)425 U·g－1·min－1。并且在相同低溫脅迫下，冷香玫瑰的POD酶活性基本大于苦水玫瑰的POD活性。

2.5 不同低溫脅迫對(duì)游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

游離脯氨酸在植物對(duì)抗低溫脅迫時(shí)可平衡細(xì)胞代謝，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定性。脯氨酸在冰凍期間防止細(xì)胞由于脫水而引起的傷害，低溫脅迫下脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速增加，可以降低細(xì)胞水勢(shì)，以此來(lái)避免凍害的發(fā)生［12－13］。游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在低溫脅迫下呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。由表3所示，2種玫瑰游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈“上升－下降－再上升－再下降”趨勢(shì)。其中，在－25℃和－35℃時(shí)出現(xiàn)2個(gè)高峰期，－25℃時(shí)達(dá)最高峰。當(dāng)溫度為－15～－25℃時(shí)，游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷上升，當(dāng)溫度為－35～－40℃時(shí)，游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢下降?？傮w上看，相同低溫脅迫條件下，冷香玫瑰的游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于苦水玫瑰的游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.6 不同低溫脅迫后水培恢復(fù)生長(zhǎng)的差異

生長(zhǎng)恢復(fù)法是最直觀的判斷樹(shù)木受凍害或是否存活的方法。在樹(shù)木遭受凍害后，用枝條是否存活及其萌芽情況確定2種玫瑰的抗寒性。采用人工低溫脅迫處理，對(duì)枝條進(jìn)行水培法恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)，15 d后待發(fā)芽情況穩(wěn)定，調(diào)查統(tǒng)計(jì)萌發(fā)情況，如表3所示，2種玫瑰成活率呈下降趨勢(shì)，總體上看，在相同低溫脅迫下，冷香玫瑰成活率高于苦水玫瑰。當(dāng)溫度為－15～－25℃時(shí)，2種玫瑰成活率均在90%以上;當(dāng)溫度為－30～－40℃時(shí)，苦水玫瑰成活率迅速下降，而冷香玫瑰成活率呈緩慢下降趨勢(shì);當(dāng)溫度為－40℃時(shí)，苦水玫瑰成活率降至30%，冷香玫瑰成活率降至67%，說(shuō)明此時(shí)2種玫瑰仍可存活，并且冷香玫瑰的抗寒能力強(qiáng)于苦水玫瑰。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)苦水玫瑰和冷香玫瑰2品種的相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)生理指標(biāo)的測(cè)定與分析，可知這些生理指標(biāo)同植物抗寒力有一定相關(guān)性，得出苦水玫瑰和冷香玫瑰均較耐寒，苦水玫瑰低溫脅迫半致死溫度為－43.3℃，冷香玫瑰低溫脅迫半致死溫度為－44.9℃，冷香玫瑰的抗寒性略強(qiáng)于苦水玫瑰。對(duì)2種玫瑰進(jìn)行水培恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果可知，2種玫瑰在－40℃低溫下仍可存活，并且冷香玫瑰枝條存活率明顯大于苦水玫瑰，是較抗寒品種。

黑龍江地區(qū)屬寒溫帶—溫帶濕潤(rùn)—半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，冬季寒冷且長(zhǎng)，極端最低氣溫達(dá)－52.3℃(漠河地區(qū))。由于冬季溫度過(guò)低使得引種樹(shù)木大多受到寒害，不利存活，以致黑龍江地區(qū)的園林綠化樹(shù)種過(guò)于單調(diào)。通過(guò)本試驗(yàn)的研究表明，苦水玫瑰和冷香玫瑰均具有較強(qiáng)的抗寒性，適宜在黑龍江地區(qū)推廣綠化應(yīng)用，因此，極大地豐富了黑龍江地區(qū)的觀干觀花樹(shù)種，且進(jìn)一步促進(jìn)了香料工業(yè)、食品工業(yè)等的發(fā)展。

本試驗(yàn)結(jié)果是在人工低溫脅迫處理下得出的，在自然界中仍有許多因子影響其抗寒性，室內(nèi)人工低溫脅迫并不能完全反應(yīng)植物的抗寒性，需要進(jìn)行應(yīng)用的深入研究，尤其是抗寒相關(guān)基因方面。目前，許多學(xué)者已經(jīng)開(kāi)始著手研究植物中不同的抗寒基因，如CBF家族基因、COR基因等。因此，對(duì)植物抗寒性的研究，應(yīng)該綜合考慮，并進(jìn)一步研究抗寒玫瑰品種中含有的不同抗寒基因，為研究新的抗寒品種提供理論依據(jù)。

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