史倩倩 王 雁 周 琳

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

黃國偉

(湖北林業(yè)科學(xué)研究院)

牡丹(Paconia suffruticosa Andr.)是芍藥科芍藥屬名貴的觀賞植物和藥用植物，作為中國傳統(tǒng)名花的優(yōu)秀代表，其姿態(tài)萬千、色彩豐富，深受人們喜愛。中國中原牡丹品種數(shù)量最多，栽培歷史悠久、分布最廣，形態(tài)變異最豐富。牡丹品種分類的方法較多，目前以花型分類的方法得到了廣泛的應(yīng)用，共分為2類 4 亞類 16 型［1］2－17。

核型是遺傳物質(zhì)在細(xì)胞水平上的表征，與外部形態(tài)相比核型受外界環(huán)境影響小，是推測物種起源、演化、分類和鑒別的重要依據(jù)［2］。譚遠(yuǎn)德等［3］在1993年提出，以核型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的核型似近系數(shù)聚類法，能較好地克服傳統(tǒng)形態(tài)分析帶來的局限性，并做到了物種間核型相似的數(shù)量化，且多向、立體、多維地考察物種間的親緣關(guān)系，使結(jié)果客觀可靠。牡丹傳統(tǒng)品種［1］8－9有別于現(xiàn)代品種，具有更豐富的遺傳信息，但前人的相關(guān)研究均未區(qū)分傳統(tǒng)品種與現(xiàn)代品種。前人對牡丹野生種及少量栽培品種進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)研究［4］286－292，［5－17］，探討了野生種及栽培品種的核型參數(shù)及野生種間的演化關(guān)系，但都未深入研究形態(tài)和核型參數(shù)之間的關(guān)系，沒有反映傳統(tǒng)品種及現(xiàn)代品種的進(jìn)化關(guān)系及現(xiàn)代品種遺傳多樣性的丟失，并且涉及傳統(tǒng)品種的研究中品種類型的代表性不足。本試驗(yàn)通過對21個典型不同花型的傳統(tǒng)中原牡丹品種核型進(jìn)行比較和聚類分析，探討傳統(tǒng)品種間核型差異，進(jìn)而探討染色體變異和花型之間的關(guān)系，旨在為牡丹品種演化研究提供線索，同時為深入研究牡丹傳統(tǒng)品種的細(xì)胞分類學(xué)問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料取自中國林業(yè)科學(xué)研究院玉泉山牡丹基地。21個中原牡丹傳統(tǒng)品種涵蓋了7個花型［1］52－207(表 1)。

表1 供試材料

2011年3月中下旬取直徑為0.5～1.5 cm的花蕾，剝除花瓣，只留花藥和子房，子房切開，用V(0.05%秋水仙素)∶V(0.02 mol·L－18 － 羥基喹啉)=1∶1混合液室溫下預(yù)處理5 h，經(jīng)卡諾固定液(V(95%乙醇)∶V(冰乙酸)=1∶3)于4℃固定24 h，經(jīng)95%乙醇沖洗2次后，轉(zhuǎn)入70%乙醇中，再放入1 mol·L－1鹽酸中，并于60℃恒溫金屬浴解離10～15 min，蒸餾水洗凈后，用卡寶品紅染色和常規(guī)壓片法制片，用蔡司AXIOIMAGER A1光學(xué)顯微鏡分別對各材料的50個染色體分散良好的中期分裂相進(jìn)行拍照。

核型分析:每個品種選出形態(tài)清晰、伸展較佳的5個細(xì)胞［2］，借助AXIOIMAGER軟件分別測量染色體及長短臂的大小。核型按Levan的分類法［18］和李懋學(xué)等［4］5－22的植物染色體標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)定分析;核型分類參照Stebbins［19］的核型分類標(biāo)準(zhǔn);核型不對稱系數(shù)參照 Arano［20］公式。

聚類分析:按譚遠(yuǎn)德等［3］提出的核型似近系數(shù)聚類分析方法和公式計(jì)算核型似近系數(shù)(λ);按吳昌謀［21］提出的公式計(jì)算核型進(jìn)化距離(De)，對似近系數(shù)利用平均聚類法(UPGMA)進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 21個中原傳統(tǒng)牡丹品種染色體核型的屬性特征與品種間的相關(guān)性

研究結(jié)果表明，供試21個品種的染色體核型穩(wěn)定，但品種間存在一定的差異。21個中原牡丹品種的染色體照片及核型模式見圖1、圖2，主要核型參數(shù)見表2。從圖1、表2可以看出，除‘首案紅’是三倍體，有15條染色體外，其他全部為二倍體，染色體數(shù)目為10;除‘茄藍(lán)丹砂’的核型類型為2B型外，其余品種的核型類型均為2A，核型不對稱系數(shù)介于59.21% ～95.70%，屬于比較對稱的核型，說明‘茄藍(lán)丹砂’的進(jìn)化程度相對較高。其觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:只有‘脂紅’沒有發(fā)現(xiàn)隨體，其余20個品種均具有隨體染色體。其中‘藍(lán)田玉’含隨體最多，具有8個隨體染色體，分別分布在第1、3、4、5對染色體上。同時發(fā)現(xiàn)花型為皇冠型的牡丹品種具有的隨體染色體數(shù)目普遍較多。

21個傳統(tǒng)中原牡丹品種的核型公式有5種形式(表2):2n=6m+2sm+2st，有‘黃花魁’、‘酒醉?xiàng)铄?、‘茄藍(lán)丹砂’、‘大棕紫’、‘錦袍紅’、‘萬花盛’、‘姚黃’、‘趙粉’、‘魏紫’、‘小魏紫’、‘假葛巾紫’、‘桃紅獻(xiàn)媚’和‘青龍臥墨池’共13個品種;2n=8m+2st，有‘大棕紫’、‘白玉’、‘豆綠’、‘金玉交章’和‘藍(lán)田玉’共5個品種;2n=4m+6sm，品種為‘脂紅’;2n=8m+2sm，品種為‘赤龍煥彩’;2n=15=9m+3sm+3st，品種是‘首案紅’。

21個中原牡丹傳統(tǒng)品種的臂比均值為1.65～2.21，其中‘錦袍紅’的臂比均值最大，為 2.21，‘赤龍煥彩’的臂比均值最小，為1.65(表2)。表3、表4表明各花型之間的臂比均值差異顯著，薔薇型的臂比均值最大，為2.14;其次為菊花型，均值為2.04;千層臺閣型的臂比均值最小，為1.76。六大花型中樓子臺閣型的臂比均值方差最大，為0.024 0;菊花型的臂比均值方差最小，為0.000 1;說明樓子臺閣型內(nèi)的臂比均值差異最大，其次為皇冠型、薔薇型、千層臺閣型、荷花型，而菊花型最一致。

通過6個花型的核型不對稱系數(shù)的比較得出(表3)，6個花型間差異不顯著，核型不對稱系數(shù)為60.22～79.12。但花型內(nèi)部的方差從大到小依次為皇冠型、樓子臺閣型、薔薇型、菊花型、荷花型和千層臺閣型。其中花型為皇冠型的‘首案紅’的核型不對稱系數(shù)明顯最大，為95.70%。

2.2 21個中原傳統(tǒng)牡丹品種親緣關(guān)系相關(guān)性的聚類分析

依據(jù)核型似近系數(shù)和核型進(jìn)化距離的計(jì)算原理與方法計(jì)算出21種中原牡丹傳統(tǒng)品種兩兩之間的核型似近系數(shù)和進(jìn)化距離，再利用平均聚類法(UPGMA)進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖3。

在21種中原牡丹傳統(tǒng)品種中，‘豆綠’與‘姚黃’的核型似近系數(shù)最大，為0.998 2，進(jìn)化距離最小，為0.001 8，親緣關(guān)系最近;‘白玉’與‘魏紫’的核型似近系數(shù)最小，為0.852 6，進(jìn)化距離最大，為0.159 5，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，各供試材料間的核型近似系數(shù)均在0.850 0以上，進(jìn)化距離間隔很小，這說明了21個中原牡丹傳統(tǒng)品種在核型上穩(wěn)定性和相似性很高。由圖3可見，21個中原牡丹傳統(tǒng)品種在核型進(jìn)化距離為0.0552、似近系數(shù)為0.9420處聚成兩大類:‘白玉’和‘魏紫’獨(dú)立于其他19個品種聚成一類。其中‘首案紅’在進(jìn)化距離0.040 5、似近系數(shù)0.960 3時與其他18個品種聚成一類，而這18個品種在進(jìn)化距離0.014 0、似近系數(shù)0.986 1時又分為兩大類:‘黃花魁’、‘桃紅獻(xiàn)媚’、‘大棕紫’和‘黑花魁’4個品種聚成一類，其他14個品種聚成一類。屬于托桂型的‘青龍臥墨池’和屬于薔薇型的‘錦袍紅’在似近系數(shù)0.975 6時聚為一類。7類花型21個中原牡丹傳統(tǒng)品種的核型聚類結(jié)果并沒有完全依據(jù)花型分類。

圖1 21個中原傳統(tǒng)牡丹品種有絲分裂中期圖

3 結(jié)論與討論

本研究通過對7類花型的21個中原牡丹傳統(tǒng)品種核型參數(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)‘首案紅’的染色體為2n=15，三倍體;其他20個品種的染色體為2n=10，二倍體，與前人研究的結(jié)果相吻合［17］，同時說明了‘首案紅’的進(jìn)化較其余品種高。

楊滌清等［7］和張贊平等［11，15］都認(rèn)為牡丹種間核型的差異主要表現(xiàn)在隨體的數(shù)目和位置上，并認(rèn)為隨體數(shù)目及隨體染色體的雜合性是牡丹種間差異的一個重要的細(xì)胞學(xué)特征。本試驗(yàn)的21個品種中，只有‘脂紅’沒有發(fā)現(xiàn)隨體，說明該品種的進(jìn)化程度相對其他品種有所不同。隨體位置主要涉及到第1、2、4、5對染色體短臂上，而‘藍(lán)田玉’、‘假葛巾紫’和‘桃紅獻(xiàn)媚’在第3對染色體的短臂也出現(xiàn)了隨體，說明這3個品種的進(jìn)化程度高。觀察發(fā)現(xiàn)花型為皇冠型的品種具有隨體的數(shù)目較多。因此，隨體數(shù)量及位置的差異是否反映了供試21個品種起源的差異有待進(jìn)一步研究。

圖2 21個中原傳統(tǒng)牡丹品種的染色體核型模式圖

著名植物分類學(xué)家和進(jìn)化學(xué)家 Stebbins［19］提出，被子植物核型進(jìn)化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展的。在系統(tǒng)演化上處于較古老或原始的植物，往往具有較對稱的核型，而不對稱的核型則通常出現(xiàn)在較進(jìn)化或特化的植物中。本試驗(yàn)中的20個牡丹傳統(tǒng)品種核型類型是較為對稱的2A型，只有‘茄藍(lán)丹砂’的核型類型為2B型，說明‘茄藍(lán)丹砂’比其他20個品種進(jìn)化程度高，可能相對而言產(chǎn)生的年代要晚一些。

依據(jù)侯小改等［17］的牡丹進(jìn)化觀點(diǎn)，牡丹品種的核型存在著多樣性，這也許跟牡丹擁有多種花型及花型易變異的現(xiàn)象有著密切的聯(lián)系。得出以下結(jié)論:具有2n=6m+2sm+2st的品種不對稱性最高;具有2n=4m+6sm和2n=8m+2st的品種不對稱性次之;具有2n=8m+2sm的品種最原始，即‘赤龍煥彩’。核型不對稱系數(shù)是反映染色體對稱與否、進(jìn)化與否的另一個參數(shù)指標(biāo)［4］171。在本試驗(yàn)中核型不對稱系數(shù)以‘首案紅’最大，而‘赤龍煥彩’則屬于較小的，說明‘赤龍煥彩’的產(chǎn)生時間早于其他供試品種，較原始，而‘首案紅’比較復(fù)雜，是相對進(jìn)化或原始，有待進(jìn)一步研究。

表2 21個中原傳統(tǒng)牡丹品種的主要核型參數(shù)

表3 6個花型染色體臂比均值、核型不對稱系數(shù)方差分析及多重比較

表4 6個花型間染色體臂比均值、核型不對稱系數(shù)方差分析

傳統(tǒng)品種花型間的核型不對稱系數(shù)差異不顯著，由低到高依次為:荷花型、薔薇型、千層臺閣型、菊花型、樓子臺閣型、皇冠型，這與王蓮英［1］14－19提出牡丹品種按花型演進(jìn)的途徑的觀點(diǎn)基本一致，而試驗(yàn)中的菊花型和千層臺閣型的品種沒有遵循傳統(tǒng)的花型演進(jìn)途徑，極有可能是因?yàn)檫@2個花型的品種栽培年代晚一些或栽培條件不同。傳統(tǒng)品種花型內(nèi)部的核型不對稱系數(shù)差異較大，從小到大依次為千層臺閣型、菊花型、荷花型、薔薇型、樓子臺閣型和皇冠型，說明千層臺閣型品種的核型類型較一致，而皇冠型品種的核型類型差異最大。

圖3 21個中原傳統(tǒng)牡丹品種核型似近系數(shù)聚類圖

臂比均值體現(xiàn)的是一個核型內(nèi)所有染色體整體的不對稱性。觀察的21個品種中‘赤龍煥彩’臂比均值(1.65)最小，核型較對稱，跟核型類型分析的結(jié)果一致，也證明了其原始性。還發(fā)現(xiàn)各花型之間的臂比均值差異顯著，菊花型的臂比均值較大，說明該花型的核型不對稱性。通過各花型的臂比均值方差比較得到菊花型的核型類型最一致，樓子臺閣型和皇冠型一致性最差，與核型不對稱系數(shù)得出的結(jié)論基本吻合，表明材料中的菊花型品種進(jìn)化程度較高。

依據(jù)數(shù)值分類學(xué)原理和似近分析理論得出的核型似近系數(shù)及核型進(jìn)化距離能夠多向、立體、多維地考察物種間的相似性，從而判斷物種間的親緣關(guān)系和遺傳距離［2］。目前核型似近系數(shù)聚類分析方法應(yīng)用較少，僅分析過蝗蟲、雞、禽類、豬、牦牛、榛子、風(fēng)毛菊屬植物、紫花苜蓿、青稞和大花蕙蘭，發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與品種分化歷史基本一致［2，22－30］。文中對21個中原牡丹傳統(tǒng)品種的親緣關(guān)系與進(jìn)化距離進(jìn)行了分析，結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果不完全相同。似近系數(shù)為0.850 0以上，進(jìn)化距離間隔小，這說明了21個中原牡丹傳統(tǒng)品種在核型上穩(wěn)定性和相似性很高。同屬于皇冠型的‘豆綠’和‘姚黃’，‘藍(lán)田玉’和‘趙粉’親緣關(guān)系最近，遺傳背景相似。在進(jìn)化距離為0.014 0、似近系數(shù)為 0.9861 時，‘黃花魁’、‘桃紅獻(xiàn)媚’、‘大棕紫’和‘黑花魁’4個品種聚成一類。而這4個品種分屬于4個不同的花型。屬于托桂型的‘青龍臥墨池’和屬于薔薇型的‘錦袍紅’在似近系數(shù)為0.975 6時聚為一類?！装讣t’在似近系數(shù)0.960 3處自成一組，這充分說明其在進(jìn)化過程中的特殊性。文中的研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞學(xué)水平上大致符合牡丹組依據(jù)花型分類的結(jié)果，可能原因是由于這些傳統(tǒng)品種栽培年代、條件不同，也許經(jīng)品種雜交選育，花型容易發(fā)生變異，核型分析中的人為誤差以及核型似近系數(shù)聚類分析方法的適用性等。因此，中原牡丹傳統(tǒng)品種分類和鑒定問題及細(xì)胞學(xué)與形態(tài)學(xué)之間的關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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