劉楊 任力 季培紅 王迎軍

(華南理工大學材料科學與工程學院∥國家人體組織功能重建工程技術研究中心∥廣東省生物醫(yī)學工程重點實驗室，廣東廣州510640)

隨著生物材料和組織工程技術的飛速發(fā)展，根據(jù)組織工程學的要求，最理想的生物醫(yī)用支架材料應該是無毒、生物相容性好、可生物降解且降解產(chǎn)物無毒副作用的天然材料［1-3］.海藻酸鹽由于容易凝膠化、生物相容性好等優(yōu)點而被廣泛應用于化學、生物、醫(yī)藥、食品，環(huán)保等領域［4-8］.由于離子交聯(lián)的海藻酸鹽水凝膠可以在冰水、熱水以及室溫條件下形成，而且反應條件溫和，簡單易行，且可注射、可原位凝膠化，而被廣泛應用于組織工程領域［9-10］.

在生物醫(yī)學系統(tǒng)和組織工程應用中，過量異體蛋白質(zhì)的引入會引起強烈的宿主免疫反應，因此海藻酸鈉(AlgNa)在應用于組織工程研究時必須除去其中過量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)［11］.文中通過丙酮沉淀法［12-13］對海藻酸鈉進行了提純，得到了較純的組織工程用海藻酸鈉樣品，該方法所得到的產(chǎn)物純度較高，產(chǎn)物性能穩(wěn)定，并且制備過程簡單.

組織工程支架材料的孔隙率以及其中孔洞的尺寸與分布，對細胞在材料中的粘附、增殖和分化來說至關重要.海藻酸鈉與鈣離子交聯(lián)能夠形成三維的生物相容性多孔支架材料，可以用來作為細胞生長的外環(huán)境［14］，不同工藝條件下制備出的支架材料的內(nèi)部孔洞結(jié)構(gòu)存在很大的區(qū)別.文中通過CaCl2-AlgNa，CaSO4/GDL-AlgNa，Ca-EDTA/GDL-AlgNa 三種交聯(lián)體系制備了多種海藻酸鈣三維多孔支架材料，其中后兩種體系采用鈣離子原位釋放法交聯(lián)制得.

1 實驗方法

1.1 主要實驗原料

海藻酸鈉原料(實驗試劑)、二水硫酸鈣(AR)、乙二胺四乙酸二鈉(AR)和無水硫酸鈉(AR)由天津福晨化學試劑廠提供，牛血清蛋白(生化試劑)由上海博奧生物科技有限公司提供，丙酮(AR)由廣東光華化學廠有限公司提供，CoomassieG-250(超級純)由廣州威佳科技有限公司提供，無水氯化鈣(AR)由天津市化學試劑一廠提供，碳酸鈣由廣州化學試劑廠提供，GDL(AR)由ALFA AESAR公司提供.

1.2 海藻酸鈉原料的提純

根據(jù)Vidal-Serp等的方法［12-13］，通過高速離心(GL-10MD，湖南湘儀儀器廠生產(chǎn))、G14漏斗抽濾、丙酮溶解、洗滌、真空干燥、冷凍干燥等過程對海藻酸鈉原料進行提純，重復此操作3次，最后得到純化后的海藻酸鈉樣品.用精密電子天平(BP211D，美國雙杰兄弟公司)稱量出提純后所得的海藻酸鈉質(zhì)量m2，根據(jù)Q=m2/m1×100%，測定樣品提純的產(chǎn)率Q，其中m1為提純前的原料質(zhì)量.

1.3 純化后海藻酸鈉的表征

為表征材料提純前后結(jié)構(gòu)的變化，對提純前后的樣品進行了紅外測試(iS10，美國NICOLET儀器公司生產(chǎn))，掃描范圍為4000～400 cm-1.相對分子質(zhì)量是決定海藻酸鹽水凝膠等彈性體材料力學性能的關鍵因素之一［15］，通過調(diào)整海藻酸鈉的相對分子質(zhì)量可以控制離子交聯(lián)的海藻酸鹽支架材料的力學性能［16］.對海藻酸鈉溶液進行GPC測試(HT-GPC，美國VISCOTEK公司生產(chǎn))，進樣體積為100 μL.精確稱取提純前和提純后的海藻酸鈉樣品各5 mg，分別溶于100 mL水中，根據(jù)文獻［13］中所報道的方法，利用紫外分光光度計(UV-3802，優(yōu)尼特設備有限公司生產(chǎn))測定了純化前和純化后的樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量.

1.4 海藻酸鈣多孔支架的制備

配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的AlgNa溶液和0.2mol/L的CaCl2溶液，分別取以上5種濃度的AlgNa溶液各20mL于編號為A1-A5的燒杯中，確定一個固定值 P=［Ca2+］/［COO-］=0.18［13］，加入對應量的 CaCl2溶液，攪拌5min.

配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的AlgNa溶液，分別取以上5種濃度的海藻酸鈉溶液各20 mL置于編號為B1-B5的燒杯中，確定P=［Ca2+］/［COO-］=0.18［13］、確定 Q=［GDL］/［Ca2+］=2，加入對應量的CaSO4·2H2O和GDL粉末，磁力攪拌5min.

稱取7.45g EDTANa2和2g CaCO3粉末放入100 mL去離子水中充分發(fā)生螯合反應，形成0.2 mol/L的Ca-EDTA溶液，并配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的AlgNa溶液.分別取這5種濃度的海藻酸鈉溶液各20 mL置于編號為C1-C5的燒杯中，確定 P=［Ca2+］/［COO-］=0.18［13］、確定 Q=［GDL］/［Ca2+］=2，加入對應量的 Ca-EDTA溶液和GDL粉末，磁力攪拌5min.

將以上3種交聯(lián)體系在室溫下靜置60 min，待溶液交聯(lián)形成水凝膠后，將水凝膠放入-20℃冰箱中放置4h，再轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中放置2h，然后將冷凍后的水凝膠冷凍干燥48 h，得到具有三維多孔結(jié)構(gòu)的支架材料.

1.5 海藻酸鈣多孔支架的表征

制備大小為6mm×6mm×5mm的3種體系制得的海藻酸鈣支架樣品，真空下對樣品表層噴金，加速電壓10kV，進行掃描電鏡(JSW-6360LV，日本島津公司生產(chǎn))觀察.將由1%、1.5%、2%、2.5%、3%的海藻酸鈉制備出的海藻酸鈣支架材料制備成大小為1.0cm×1.0cm×1.5cm的柱狀，利用萬能電子拉力試驗機(AG-1型，日本島津公司生產(chǎn))進行載荷測試，加壓速度為2 mm/min.對Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系中由2.5%的海藻酸鈉溶液制備出的海藻酸鈣三維多孔支架進行Micro-CT評價測試(eXplore Locus，通用電氣公司生產(chǎn))，測定支架材料的比表面積、孔徑以及一些其他結(jié)構(gòu)信息.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉的提純產(chǎn)率

提純后的海藻酸鈉質(zhì)量m2=1.637g，提純前的原料質(zhì)量m1=3 g，樣品產(chǎn)率Q=54.6%.這表明通過高速離心、G4漏斗抽濾、丙酮沉淀、洗滌、真空干燥、冷凍干燥等過程，去掉了海藻酸鈉原料中的大量雜質(zhì)，得到了較純的海藻酸鈉樣品.

2.2 紅外光譜分析

圖1 海藻酸鈉的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of sodium alginate

圖1是將提純前和提純后的海藻酸鈉樣品在4000～400cm-1區(qū)間內(nèi)進行紅外光譜掃描得到的譜圖.其中顯示了海藻酸鈉的一些特征吸收峰:O—H的吸收峰為3450cm-1，C—H的伸縮振動吸收峰為2930cm-1，1200～1300cm-1的寬強吸收峰是海藻酸鈉中—O—基團的吸收峰，1610 cm-1處是吡喃環(huán)化合物C—O—C的伸縮振動峰，1030 cm-1附近的吸收峰是海藻酸鈉中環(huán)醇結(jié)構(gòu)上的—OH的振動峰.另外，相比提純前的海藻酸鈉，提純后的海藻酸鈉樣品在1420cm-1左右出現(xiàn)的吸收峰明顯減弱，而這正是蛋白質(zhì)氨基酸中羧酸根離子的對稱伸縮振動峰，這表明提純后材料中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量大為減少.

2.3 GPC測定的海藻酸鈉相對分子質(zhì)量

通過調(diào)節(jié)海藻酸鈉的相對分子質(zhì)量可以控制離子交聯(lián)的海藻酸鹽支架材料的力學性能.凝膠滲透色譜法測定提純后的海藻酸鈉的數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)為1.48×105，重均相對分子質(zhì)量(Mw)為2.65×105，峰值相對分子質(zhì)量(Mp)為2.24 ×105，Z均相對分子質(zhì)量(Mz)為4.15×105.海藻酸鈉樣品的多分散性系數(shù)(Mw/Mn)為1.79～1.80，屬于一般多分散性樣品.相較于初始原料，提純后樣品的相對分子質(zhì)量有一定的下降，這可能與提純過程中機械應力和有機溶劑的作用使聚合物的分子鏈斷裂有關.

2.4 剩余蛋白質(zhì)的含量

圖2是利用紫外分光光度計測定的蛋白質(zhì)溶液在589nm處的吸光度-濃度標準曲線.提純前的海藻酸鈉中蛋白質(zhì)的含量高達(40±5)%.而純化后得到的樣品溶液中蛋白質(zhì)的濃度僅為1.7072mg/L，剩余蛋白質(zhì)雜質(zhì)的質(zhì)量僅占純化后樣品總質(zhì)量的3.4%，低于文獻中所報道的其他方法，如酸沉淀法(約為6.7%)和活性炭法(約為8.5%)結(jié)果［13］.研究表明，純化后，海藻酸鈉原料中超過90%的蛋白質(zhì)雜質(zhì)被除掉，得到了較純的海藻酸鈉樣品.

圖2 蛋白質(zhì)含量的標準曲線Fig.2 Standard curve of protein content

2.5 海藻酸鈣支架的SEM圖像

組織工程支架材料的孔隙率以及其中孔洞的尺寸與分布，對細胞在材料中的粘附、增殖和分化來說至關重要，不同工藝條件下制備出的海藻酸鈣支架材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在很大的區(qū)別.圖3是未交聯(lián)的海藻酸鈉凍干樣品的SEM照片，未交聯(lián)的海藻酸鈉呈片層狀且結(jié)構(gòu)稀疏而不規(guī)則.

圖3 未交聯(lián)的AlgNa的SEM圖Fig.3 SEM images of sodium alginate(uncrosslinked)

圖4(a)-(e)是由CaCl2-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣三維多孔支架的SEM圖像.通過掃描電鏡對材料中孔徑大小及孔隙分布的觀察發(fā)現(xiàn)，在CaCl2-AlgNa這一交聯(lián)體系中，交聯(lián)明顯但不均勻.這是由于CaCl2溶液在加入到該體系中時，直接以Ca2+溶液的形式參加交聯(lián)反應，不存在Ca2+緩慢釋放的過程，Ca2+在加入到海藻酸鈉溶液中時立刻發(fā)生交聯(lián)反應，溶液的凝膠化又限制了Ca2+在整個體系的流動，造成了材料局部交聯(lián)明顯但交聯(lián)不夠的現(xiàn)象，過快的凝膠化速率導致了材料內(nèi)部交聯(lián)程度的不同以及材料結(jié)構(gòu)的不均勻等缺陷.

圖4 CaCl2-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣支架SEM圖Fig.4 SEM images of calcium alginate porous scaffolds from(CaCl2-AlgNa)crosslinked system

圖5(a)-(e)是在CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系中通過不同濃度的海藻酸鈉制備的海藻酸鈣三維多孔支架的SEM圖.CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系的交聯(lián)程度較好，在該體系中雖然存在Ca2+緩慢釋放的過程，但由于Ca2+通過CaSO4固體溶解釋放出來的速率以及Ca2+在不同位置的濃度變化難以調(diào)節(jié)，其凝膠動力學不易控制，同時未反應的CaSO4固體也很難從支架材料中脫除，故在所得的支架材料中存在明顯的白色沉淀，這種不均勻的凝膠化導致材料不同部位的成分和結(jié)構(gòu)存在很大的差異，沉淀物的存在降低了材料結(jié)構(gòu)的均一性.

圖5 CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣支架的SEM圖Fig.5 SEM images of porous calcium alginate scaffolds fabricated from CaSO4/GDL-AlgNa crosslinking system

圖6 Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣支架的SEM圖Fig.6 SEM images of porous calcium alginate scaffolds fabricated from Ca-EDTA/GDL-AlgNa crosslinking system

圖6(a)-(e)是由Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣三維多孔支架的SEM照片.通過掃描電鏡對材料中孔徑大小及孔隙分布的觀察發(fā)現(xiàn)，在Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系中，海藻酸鈣支架的交聯(lián)程度較好且十分均一，材料中的微孔分布均勻，比表面積較大.這是由于 Ca2+在從 Ca-EDTA這一螯合體系中釋放出來之前已經(jīng)均勻地分布在整個海藻酸鈉溶液當中，隨后其釋放速率和濃度均能夠通過GDL來調(diào)節(jié)，整個交聯(lián)反應同時同步在整個體系的所有部位發(fā)生，而且Ca2+在整個Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系的各個部位，從頭到尾都保持著均一的濃度，使得材料整體的交聯(lián)反應同時發(fā)生并且均一.其中由質(zhì)量分數(shù)為2.5% ～3.0%的海藻酸鈉所制得的海藻酸鈣三維多孔支架材料中的孔徑分布在50～200μm之間，這種孔徑有利于細胞的生長.

在以上3種交聯(lián)體系中，Ca2+從各體系中釋放的方式以及海藻酸鈉溶液質(zhì)量分數(shù)的不同導致了各種海藻酸鈣支架材料在結(jié)構(gòu)上存在著巨大的差別.隨著海藻酸鈉濃度的增加，前兩個體系制備的材料的結(jié)構(gòu)不均一現(xiàn)象更為明顯，而在第三個體系中所有材料的結(jié)構(gòu)都很均一.這是由于海藻酸鈉溶液發(fā)生交聯(lián)反應形成海藻酸鈣時，體系各個部位凝膠化的速度與Ca2+和海藻酸鈉的濃度直接相關，而溶液一旦凝膠化又會對交聯(lián)劑中Ca2+的釋放以及Ca2+在交聯(lián)體系中的移動造成很大影響.

通過研究，我們發(fā)現(xiàn) CaCl2-AlgNa體系和CaSO4/GDL-AlgNa體系相對 Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系而言，最大的局限在于Ca2+的釋放和Ca2+的移動很難做到在體系中均一同步，因此交聯(lián)反應發(fā)生的程度和分布也做不到均一，故而很難得到理想的海藻酸鈣支架材料.

2.6 海藻酸鈣支架材料的抗壓強度

由于CaCl2-AlgNa、CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備出的海藻酸鈣支架材料在成分和結(jié)構(gòu)上明顯不均一，故只對Ca-EDTA/GDL-AlgNa體系制備出的結(jié)構(gòu)均一的海藻酸鈣多孔支架材料進行力學性能測試.利用萬能電子拉力試驗機測定 Ca-EDTA/GDL-AlgNa體系制備的海藻酸鈣三維多孔支架材料的抗壓性能.在這一交聯(lián)體系中，由質(zhì)量分數(shù)為2.5%和3.0%的海藻酸鈉所制備出的海藻酸鈣支架材料具有較好的力學強度，其最大承重可達(75.0±5.0)N(圖7(a))，高于相同體系制備的其他支架材料;濃度為3.0%的海藻酸鈉制備出的三維支架材料的抗壓強度更是高達0.8MPa(圖7(b)).研究結(jié)果表明，在合適的交聯(lián)體系中，由一定質(zhì)量分數(shù)的海藻酸鈉溶液制備出來的海藻酸鈣支架材料具有較好的抗壓能力，該材料能夠通過裁剪得到各種形態(tài)的三維支架.

圖7 Ca-EDTA/GDL-AlgNa體系制備的海藻酸鈣支架的最大承重和抗壓強度Fig.7 Maimum load and compression strength of porous calcium alginate scaffold fabricated from Ca-EDTA/GDL-AlgNa crosslinking system

2.7 海藻酸鈣支架材料的Micro-CT評價

對質(zhì)量分數(shù)為2.5%的海藻酸鈉溶液制備出的海藻酸鈣支架材料進行 Micro-CT評價測試.圖8(a)是對海藻酸鈣支架材料進行Micro-CT評價測試掃描的一個斷面圖，圖8(b)是海藻酸鈣材料表面結(jié)構(gòu)的重建圖.可以看出所得材料的內(nèi)部具有較高的孔隙率，孔隙分布均勻，且孔隙之間相互貫通.此外，通過Micro-CT的測試結(jié)果還可得知該海藻酸鈣多孔支架材料的比表面積為123.27，壁厚為4.08×10-3cm，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)為1.99，各向異性程度為3.15，分形維數(shù)為2.41，微孔的體積大約為5.10×10-7cm3，材料的孔徑大致分布在75～85 μm之間.通過Micro-CT掃描可以對材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有一個更加清晰的了解，為后續(xù)的相關研究提供一定的參考，這種支架材料有可能為細胞的粘附、生長、增殖和分泌細胞外基質(zhì)提供一個合適的三維空間.

圖8 支架斷面圖和表面結(jié)構(gòu)重建圖Fig.8 Cross-section and reconstruction images of scaffold surface

3 結(jié)論

文中采用丙酮沉淀法對海藻酸鈉進行了提純，得到了較純的組織工程用海藻酸鈉樣品.此外，通過 CaCl2-AlgNa，CaSO4/GDL-AlgNa，Ca-EDTA/GDLAlgNa三種交聯(lián)體系制備了多種海藻酸鈣三維多孔支架材料.研究表明:通過Ca-EDTA/GDL-AlgNa這一交聯(lián)體系制備出的支架材料中，由質(zhì)量分數(shù)為2.5%～3.0%的海藻酸鈉所制得的海藻酸鈣三維多孔支架材料的微孔分布均勻，比表面積較大，孔徑在50～200μm之間，且具有較好的機械強度，這樣的支架材料有可能用作組織工程和細胞工程培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基和一些其他用途的醫(yī)用敷料.

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