盧昌均，鹿俊磊，安紅偉，劉國(guó)成，周哲屹，韋冰心，陸兵勛，尹瑞雪，王立新

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原［1］。缺血性腦損傷后，盡早恢復(fù)缺血半暗帶的血供有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。腦缺血再灌注損傷時(shí)，VEGF可通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，加速新生血管的形成。因此，制作大鼠缺血再灌注損傷（MCAO）模型，采用反轉(zhuǎn)錄集合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）檢測(cè)缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)細(xì)胞因子VEGF mRNA的變化，并研究通心絡(luò)膠囊對(duì)其表達(dá)的影響，探討通心絡(luò)膠囊在缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 栓線制備 采用3－0號(hào)尼龍線，線頭一端用酒精燈將其燙成球形，在需要長(zhǎng)度處折彎作標(biāo)記，將此線浸泡消毒后，栓線頭端浸入0.1%多聚賴氨酸溶液中過(guò)夜，60℃烤箱中1h后取出，然后浸入1.25×104U肝素鹽水中備用。

1.2 動(dòng)物模型制作 選用健康雄性SD大鼠180只，體重250 g±20g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為缺血再灌注3d、5d、14d、30d共四批次進(jìn)行，每批次隨機(jī)分為通心絡(luò)劑量組、缺血再灌注模型對(duì)照組（等量的生理鹽水）和假手術(shù)組，每組12只。參考改良的線栓法大鼠缺血性及缺血再灌注模型改進(jìn)。放入栓線后用消毒鋼尺量自頸總動(dòng)脈分叉處的血管外線長(zhǎng)度，計(jì)算栓線實(shí)際的進(jìn)入長(zhǎng)度。在穿刺點(diǎn)外5mm剪斷殘留的栓線，埋于胸鎖乳突肌下。手術(shù)后縫皮，消毒切口，在缺血后90 min拔出線栓形成缺血再灌注動(dòng)物模型。根據(jù)經(jīng)典的Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分法評(píng)分（5級(jí)4分法）［2］。除假手術(shù)組外，各組選取造模后6h神經(jīng)功能缺損評(píng)分在2分以上的大鼠納人試驗(yàn)研究，癥狀輕微（0分及1分）的大鼠剔除。假手術(shù)組也插入栓線，但深度為10mm左右，不阻塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)后大鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。

1.3 給藥方法 先將通心絡(luò)膠囊內(nèi)容物溶于蒸餾水中配成溶液，通心絡(luò)組按每只1g／（kg·d）給藥，MCAO模型對(duì)照組、假手術(shù)組用等量蒸餾水分別灌胃，每組大鼠在再灌注清醒后即灌胃給藥，每日2次，給藥時(shí)間分別為3d、5d、14d、30d。

1.4 腦組織制備 將每組大鼠于末次腹腔注射BrdU后24h，在10%水合氯醛麻醉下，迅速斷頭取出腦組織，放入特制的小盒內(nèi)，緩緩平放入盛有液氮的小杯中，當(dāng)盒底接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，10s～20s后腦組織迅速冰結(jié)成塊，取出腦組織冰塊立即置入－70℃冰箱中備用。

1.5 腦組織總RNA提純分離 大鼠缺血再灌注后3d、5d、7 d和14d、21d、30d各組腦缺血側(cè)、缺血對(duì)側(cè)區(qū)腦組織，以及通心絡(luò)治療后缺血側(cè)腦組織，提取總RNA。進(jìn)行RT－PCR及半定量分析，以2% 瓊脂糖－TBE凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像；采用gel pro軟件分析，以目的片段與β－actin的光密度比值（D）作為目的片段mRNA的相對(duì)含量，分離PCR產(chǎn)物，以DL－2000Marker為參照物。

引物設(shè)計(jì)：參考Genbank核普酸序列資料，應(yīng)用Oligo5.0軟件程序設(shè)計(jì)有意義引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成純化。其具體設(shè)計(jì)如下：

2 結(jié) 果

2.1 腦組織總RNA的提取結(jié)果 二條分別代表RNA的18 s，28s清晰條帶，電泳圖譜28s和18s酶比值約為2∶1，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的RNA完整無(wú)降解。

2.2 缺血再灌注模型組與通心絡(luò)組VEGF mRNA表達(dá) 假手術(shù)組幾乎檢測(cè)不到VEGF mRNA的表達(dá)；大鼠腦缺血再灌注后在病灶對(duì)側(cè)僅見(jiàn)少量VEGF mRNA表達(dá)；缺血再灌注模型組及通心絡(luò)組病灶側(cè)VEGF mRNA在不同時(shí)間段均有表達(dá)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)增加，第5、7天最高，第14天時(shí)表達(dá)開(kāi)始下降，但通心絡(luò)組同一時(shí)間點(diǎn)VEGF mRNA的表達(dá)均較模型組增強(qiáng)。

3 討 論

缺血性腦損傷后，動(dòng)脈血管閉塞而致局部腦血流減少，腦組織缺血、缺氧，產(chǎn)生神經(jīng)組織損傷。缺血半暗帶的理論是由Astrup等1981年根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次提出的，此區(qū)域存在側(cè)支循環(huán)，部分血流可供應(yīng)此區(qū)域，尚有大量神經(jīng)元存活，如果血液迅速恢復(fù)，腦代謝得以改善，損傷仍然可逆，神經(jīng)細(xì)胞仍可存活并恢復(fù)功能，這種可逆性取決于血管的新生和側(cè)支循環(huán)的形成。腦缺血再灌注損傷時(shí)，VEGF可通過(guò)與其受體結(jié)合而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，加速新生血管的形成，提高血管通透性，并以自分泌、旁分泌和胞內(nèi)分泌的方式特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞受體，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管管型結(jié)構(gòu)形成［3］。

缺血半暗帶在缺血性腦損傷后雖然有神經(jīng)功能的缺失，但仍有潛在的存活能力，神經(jīng)細(xì)胞仍可存活并恢復(fù)功能，因此，急性腦梗死治療的關(guān)鍵是保護(hù)這些可逆性的神經(jīng)元。有研究發(fā)現(xiàn)［4］，VEGF促進(jìn)梗死區(qū)周?chē)軅?cè)支循環(huán)的建立，改善了血流動(dòng)力學(xué)狀況和疾病預(yù)后。在新生血管生成方面VEGF及其受體具有特異性，因此在缺血性腦損傷中，研究VEGF及其受體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。VEGF參與許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中風(fēng)、腦缺血的神經(jīng)保護(hù)。最近的研究表明，VEGF增強(qiáng)缺血后的神經(jīng)再生［5］。缺血或缺氧可促使VEGF及其受體的mRNA和蛋白表達(dá)、生物活性均增加［6］。本實(shí)驗(yàn)提示，缺血損傷組在術(shù)后第3天即可檢測(cè)到VEGF的表達(dá)，第5天達(dá)到高峰，第14天VEGF的表達(dá)開(kāi)始下降，第30天恢復(fù)到基線水平；而假手術(shù)組幾乎檢測(cè)不到VEGF的表達(dá)，從而證實(shí)了缺血性腦損傷誘導(dǎo)了VEGF的表達(dá)。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將本病歸屬于缺血性中風(fēng)的范疇，國(guó)家中醫(yī)藥管理局腦病急癥協(xié)作組將中風(fēng)病定位在腦和腦脈，指出缺血性中風(fēng)的病機(jī)是腦脈痹阻，與致病因素瘀最為緊密，因此治療此病的方法為活血化瘀藥，通過(guò)活血、疏通血脈、祛痰通絡(luò)從而達(dá)到治療目的。通心絡(luò)膠囊是目前臨床上治療缺血性腦血管病的常用藥物，在治療缺血性腦血管疾病中己經(jīng)取得了顯著療效；但其作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚不完全清楚。本研究以通心絡(luò)為干預(yù)因素，觀察VEGF在通心絡(luò)組及缺血對(duì)照組中變化，結(jié)果顯示：通心絡(luò)能夠促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，降低缺血后神經(jīng)功能的評(píng)分，使VEGF mRNA表達(dá)明顯增加，從而推斷通心絡(luò)膠囊能夠激活神經(jīng)干細(xì)胞的增殖或者分化，促進(jìn)VEGF基因的表達(dá)，這可能是通心絡(luò)膠囊治療缺血性腦血管疾病的機(jī)制之一。

VEGF表達(dá)的調(diào)控可能涉及多種機(jī)制，包括受一系列激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，受一些癌基因、抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)，特別是缺血、缺氧的刺激作用［7］，缺血性腦損傷通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)而發(fā)揮血管生成和神經(jīng)保護(hù)的作用。本實(shí)驗(yàn)提示，通心絡(luò)可能通過(guò)促進(jìn)VEGF大量表達(dá)，使新生血管的形成增加及側(cè)支循環(huán)的建立，降低了神經(jīng)功能的缺失，這為臨床運(yùn)用通心絡(luò)治療缺血性腦血管病提供了有利的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，在各時(shí)間點(diǎn)缺血對(duì)照組VEGF基因表達(dá)水平均低于通心絡(luò)組，通心絡(luò)組5d后VEGF mRNA開(kāi)始增加，晚于缺血對(duì)照組，在以后的各時(shí)間點(diǎn)觀察值均高于缺血對(duì)照組，一直持續(xù)到第30天；而對(duì)照組VEGF mRNA表達(dá)已回歸至基線水平。因此，推斷通心絡(luò)中的某種成分可能促進(jìn)了細(xì)胞表達(dá)VEGF或者表達(dá)該基因的細(xì)胞增加，但其具體機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)僅研究了通心絡(luò)在基因水平對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響，對(duì)于其在蛋白水平的表達(dá)尚未涉及；具體通心絡(luò)中何種成分發(fā)揮作用，以及其作用機(jī)制如何尚有待進(jìn)一步的探討。

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