韓 杰邊連全劉顯軍張 飛楊侃侃

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866;2.洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)系，洛陽(yáng) 471022;3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)科研種豬場(chǎng)，沈陽(yáng) 110866)

仔豬的免疫保護(hù)主要來(lái)自2個(gè)方面，一是從母乳中獲得的被動(dòng)免疫保護(hù)，二是自然狀態(tài)下仔豬自身免疫系統(tǒng)發(fā)育形成的主動(dòng)免疫保護(hù)。3～4周齡的仔豬由于自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，體液免疫產(chǎn)生的抗體水平和細(xì)胞免疫功能還很低，此時(shí)若實(shí)施斷奶，仔豬易發(fā)生免疫應(yīng)激，出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、飼料效率降低、腹瀉等現(xiàn)象［1－3］。此外，免疫應(yīng)激還是導(dǎo)致“仔豬早期斷奶綜合征”的重要因素之一。因此，采取一定的營(yíng)養(yǎng)措施增強(qiáng)斷奶仔豬的免疫功能，對(duì)緩解斷奶應(yīng)激所致的生長(zhǎng)抑制具有重要意義。

刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS)是從刺五加根中分離出的水溶性多糖，具有良好的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、微生態(tài)調(diào)節(jié)、抗感染等功效［4－7］。近年來(lái)，ASPS在藥理研究和臨床應(yīng)用上備受關(guān)注，但在畜禽生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用卻鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以早期斷奶仔豬為試驗(yàn)動(dòng)物，旨在研究ASPS對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)及免疫指標(biāo)的影響，并探討其在仔豬飼糧中的最佳添加水平，為ASPS作為免疫調(diào)控劑在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

選取(28±3)日齡、平均體重為(7.13±0.67)kg的“長(zhǎng)白×約克夏”二元雜交斷奶仔豬，采用半開放豬舍，地面飼養(yǎng)，自然通風(fēng)，自由采食和飲水，免疫和驅(qū)蟲程序按豬場(chǎng)常規(guī)同步進(jìn)行?；A(chǔ)飼糧是參照NRC(1998)仔豬營(yíng)養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將96頭斷奶仔豬隨機(jī)分為6組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬，試驗(yàn)期21 d。對(duì)照組飼喂不添加抗生素的基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加 150、300、500、800 和 1 000 mg/kg ASPS的試驗(yàn)飼糧。

1.3 試驗(yàn)材料

ASPS：以刺五加根為原料，采用熱水浸提乙醇分級(jí)沉淀工藝提取，苯酚－硫酸法測(cè)得多糖純度為 82.5%。

主要儀器：LRHS－150B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京萊凱博儀器設(shè)備有限公司)、BioTek-Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)、Uritest－3000型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)、過(guò)濾除菌裝置和濾膜、96孔聚丙乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底)。

主要試劑：稀釋液［0.05 mol/L pH 9.6 碳酸鹽緩沖液、0.01 mol/L pH 7.2 磷酸鹽緩沖液(PBS)］、洗滌液(PBS中加 0.05%吐溫 －20)、封閉液(PBS中加10%胎牛血清)、鄰苯二胺(OPD，美國(guó)Sigma公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬免疫球蛋白G(HRP－兔抗豬IgG)、臺(tái)盼藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆球蛋白A(ConA，美國(guó)Sigma公司)、RPMI-1640完全培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)、淋巴細(xì)胞分離液。

1.4 試驗(yàn)過(guò)程及樣品制備

試驗(yàn)于開始和結(jié)束時(shí)，清晨稱量空腹仔豬的個(gè)體重，記錄始重(initial body weight，IBW)和末重(final body weight，F(xiàn)BW)，計(jì)算每頭仔豬的平均日增重(average daily gain，ADG);準(zhǔn)確記錄各重復(fù)中仔豬的投料量和余料量，計(jì)算每頭仔豬的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI);根據(jù)ADG和ADFI計(jì)算料重比(feed/gain，F(xiàn)/G);每日觀察仔豬的腹瀉情況，記錄每天的腹瀉頭次，計(jì)算腹瀉率(diarrhea rate，DR)。

試驗(yàn)第14天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取1頭仔豬，肌肉注射1 mg/kg體重雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA，美國(guó)Sigma公司，純度＞90%)。試驗(yàn)第21天，取每個(gè)重復(fù)中第14天注射過(guò)OVA的仔豬，用真空采血管前腔靜脈采集血液2份，1份用不帶有肝素的普通真空采血管采血5 mL，3 500 r/min離心5 min，分離血清，－20℃冰箱凍存，用于測(cè)定血清特異OVA抗體和皮質(zhì)醇水平;1份用肝素抗凝管采血5 mL，于4℃冰箱保存，用于外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(lymphocyte proliferation，LP)的測(cè)定。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

1.5.2 腹瀉率

1.5.3 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應(yīng)比色法(簡(jiǎn)稱MTT法)，在10 mL離心管中加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，然后沿管壁緩慢加入3 mL肝素抗凝血，2 500 r/min離心20 min，取中間白細(xì)胞層約1 mL，加入3～5倍體積的RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌3次，每次2 000 r/min離心10 min，棄上清。然后將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞(＞95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。

向細(xì)胞懸液中加入ConA(終濃度為5 μg/mL)，另設(shè)一對(duì)照組加入等體積的 RPMI-1640完全培養(yǎng)液，然后加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)樣品設(shè) 3 個(gè)重復(fù)，置 5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，于培養(yǎng)板每孔內(nèi)加入10 μL MTT(初始濃度為5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔再加入100 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)－0.04 mol/L HCl溶液，30 min后用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值(OD值)。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率用刺激指數(shù)(SI)表示，SI=ConA刺激孔OD570nm/對(duì)照孔OD570nm。

1.5.4 血清特異性O(shè)VA抗體水平

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血清特異性O(shè)VA抗體水平。首先用稀釋液與OVA按照50∶1混合制成包被液，加入酶聯(lián)反應(yīng)板各孔，每孔200 μL，37℃包被2 h。棄去孔內(nèi)液體后，用洗滌液注滿各孔，洗滌3次，每次3 min，然后棄去洗滌液;每孔加入100 μL封閉液封閉1 h，洗滌后得包被平板。將100 μL用稀釋液稀釋40倍的待檢血清加入包被板各孔，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，37℃反應(yīng)1 h。再用洗滌液注滿各孔，洗滌3次后，每孔加入100 μL HRP－兔抗豬IgG，37℃反應(yīng)30 min。再用洗滌液注滿各孔，洗滌3次后，每孔加入新配制的底物(40 mg OPD溶于100 mL pH 5的磷酸－檸檬酸緩沖液中，臨用前加入0.15 mL 30%H2O2150 μL，37 ℃反應(yīng) 30 min。最后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。

1.5.5 血清皮質(zhì)醇水平

采用皮質(zhì)醇ELISA試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)測(cè)定血清皮質(zhì)醇水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理，然后利用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型(GLM)進(jìn)行方差分析，對(duì)不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)確定為差異顯著。并參照文獻(xiàn)［8－9］的分析方法，通過(guò) SPSS 11.5系統(tǒng)的二次曲線回歸分析以及broken-1ine分析，求獲得最大生長(zhǎng)速度的添加水平。

2 結(jié)果

2.1 ASPS對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，各組仔豬的IBW差異均不顯著(P＞0.05);500 mg/kg ASPS組和 800 mg/kg ASPS組仔豬的FBW均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，1 000 mg/kg ASPS 組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。飼糧中添加ASPS對(duì)仔豬的ADFI和F/G影響不顯著(P＞0.05)，但能顯著提高仔豬的ADG(P＜0.05)，隨ASPS添加水平增加，F(xiàn)BW 和ADG均呈二次曲線變化(P＜0.01)，F(xiàn)/G呈線性改善(P＜0.05)。通過(guò)對(duì) ADG的broken-1ine分析和二次曲線回歸分析可知，獲得最大生長(zhǎng)速度的添加水平分別為869和728 mg/kg，可見，在本試驗(yàn)條件下，ASPS在斷奶仔豬飼糧中的添加量以800 mg/kg為宜。

2.2 ASPS對(duì)斷奶仔豬腹瀉率的影響

由表3可知，飼糧中添加ASPS能顯著降低仔豬的腹瀉率(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加300(P ＜0.05)、500(P ＜0.01)和 800 mg/kg ASPS(P＜0.01)降低了仔豬的腹瀉率。通過(guò)對(duì)不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知，隨ASPS添加水平的增加，腹瀉率呈二次曲線變化(P＜0.01)。

表2 ASPS對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of ASPS supplementation on growth performance of weaner piglets

表3 ASPS對(duì)斷奶仔豬腹瀉率的影響Table 3 Effects of ASPS supplementation on diarrhea ratio of weaner piglets

2.3 ASPS對(duì)斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清特異性O(shè)VA抗體和皮質(zhì)醇水平的影響

由表4可知，飼糧中添加不同水平ASPS能顯著提高仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，500 mg/kg ASPS組(P＜0.05)、800 mg/kg ASPS 組(P ＜0.01)、1 000 mg/kg ASPS組(P＜0.05)仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著或極顯著升高。隨ASPS添加水平的增加，外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率呈線性變化(P＜0.01)。飼糧中添加不同水平的ASPS對(duì)仔豬血清特異性O(shè)VA抗體水平影響均不顯著(P＞0.05)。添加ASPS能顯著降低仔豬血清皮質(zhì)醇水平(P＜0.05)，其中，飼糧中添加500、800和1 000 mg/kg ASPS顯著降低了仔豬血清皮質(zhì)醇水平(P＜0.05)，隨ASPS添加水平的增加，血清皮質(zhì)醇水平呈線性變化(P ＜0.01)。

3 討論

3.1 ASPS對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

目前，將ASPS應(yīng)用于斷奶仔豬生產(chǎn)中的研究還未見報(bào)道，但有將刺五加水提物應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)中的相關(guān)報(bào)道。例如，劉合軍等［10］在飼糧中添加0.1%刺五加水提物顯著提高了早期斷奶仔豬的ADFI和ADG，并顯著防治了早期斷奶仔豬腹瀉。燕富永［11］研究表明，0.1%刺五加水提物顯著提高了仔豬ADG，極顯著降低了飼料轉(zhuǎn)化效率(FCR)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜水平的ASPS能顯著提高斷奶仔豬ADG和降低仔豬腹瀉率，這與前述的研究結(jié)果基本一致。但本試驗(yàn)中ASPS對(duì)ADFI及F/G無(wú)顯著影響，這與前述在仔豬飼糧中添加刺五加水提物的效果不一致，究其原因，一方面可能因?yàn)榇涛寮铀嵛锱c刺五加多糖的成分差異(刺五加水提物是刺五加中多種成分的混合物，除含有ASPS外，還含有刺五加苷、黃酮、微量元素和氨基酸等)所致;另一方面，可能因?yàn)锳SPS味辛、微苦，而豬的味覺和嗅覺非常靈敏，這可能是導(dǎo)致ASPS對(duì)仔豬ADFI無(wú)顯著影響的原因。對(duì)試驗(yàn)1～21 d ADG的broken-1ine分析和二次回歸分析，獲得最大生長(zhǎng)速度的最佳添加水平分別為869和728 mg/kg，可見，結(jié)合本試驗(yàn)ASPS的添加水平，APS在斷奶仔豬飼糧中的添加量以800 mg/kg為宜。

表4 ASPS對(duì)斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清特異性O(shè)VA抗體和皮質(zhì)醇水平的影響Table 4 Effects of ASPS supplementation on peripheral blood lymphocyte proliferation，serum specific ovalbumin antibody and cortisol levels of weaner piglets

3.2 ASPS對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

在ASPS影響細(xì)胞免疫方面，如謝蜀生等［12］研究表明，在小鼠體內(nèi)注射ASPS對(duì)小鼠全脾細(xì)胞以及去T細(xì)胞后的脾細(xì)胞都有強(qiáng)的促有絲分裂作用;孟繁磊等［13］研究表明，刺五加葉均一多糖組分對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用。淋巴細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化率)是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)［14］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ASPS可以顯著提高斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，這與前述的以往研究結(jié)果一致，提示ASPS有增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能的作用，對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育還不完善的早期斷奶仔豬來(lái)說(shuō)，細(xì)胞免疫功能的改善可以在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體對(duì)微生物入侵和疾病的抵抗能力。

在ASPS影響體液免疫研究方面，Han等［15］從刺五加組織培養(yǎng)的果實(shí)中分離獲得一種均一化多糖可增加小鼠分泌免疫球蛋白M(IgM)的B細(xì)胞數(shù)量，提示ASPS對(duì)小鼠體液免疫功能具有一定影響。本試驗(yàn)通過(guò)給仔豬注射OVA抗體使仔豬致敏以評(píng)價(jià)體液免疫水平，結(jié)果表明ASPS對(duì)仔豬血清特異性O(shè)VA抗體水平影響不顯著，提示ASPS對(duì)仔豬體液免疫功能影響不顯著，這與前述的研究結(jié)果不一致，分析這種結(jié)果的差異可能是研究動(dòng)物小鼠和仔豬的種屬差異所致。

3.3 ASPS對(duì)斷奶仔豬斷奶應(yīng)激的影響

皮質(zhì)醇是由下丘腦－垂體－腎上腺軸分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要成分，其水平高低可作為衡量應(yīng)激程度的一個(gè)重要指標(biāo)［16］。Founderburke等［17］研究了心理、溫度、營(yíng)養(yǎng)3種應(yīng)激因素對(duì)28日齡斷奶仔豬生理和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度應(yīng)激組仔豬(環(huán)境溫度從斷奶前29℃降至斷奶后13℃)比自然吮乳組仔豬增重顯著加快，斷奶心理應(yīng)激組和環(huán)境溫度應(yīng)激組血液生長(zhǎng)激素和胰島素水平顯著升高，而營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激組仔豬出現(xiàn)失重，血清胰島素水平顯著降低，血清皮質(zhì)醇水平顯著升高。本試驗(yàn)中ASPS使仔豬血清皮質(zhì)醇水平顯著降低，表明ASPS有緩解應(yīng)激的作用，這也可能是ASPS促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)的原因之一。

4 結(jié)論

①飼糧中添加ASPS可以顯著提高斷奶仔豬的ADG，改善血液免疫指標(biāo)，降低仔豬的應(yīng)激反應(yīng)和腹瀉的發(fā)生。

②在本試驗(yàn)條件下，ASPS在仔豬飼糧中的添加量以800 mg/kg效果最好。

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