宋衍秋，趙莉莉，毛用敏*，趙鴻銘，徐美林，崔讓莊

（天津市胸科醫(yī)院1.天津市心血管病研究所;2.病理科，天津 300050）

重組腺病毒Ad-hBNP的構(gòu)建及其在CHF大鼠中的分布與表達(dá)

宋衍秋1，趙莉莉1，毛用敏1*，趙鴻銘1，徐美林2，崔讓莊1

（天津市胸科醫(yī)院1.天津市心血管病研究所;2.病理科，天津 300050）

目的 構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP，觀察其在CHF大鼠體內(nèi)的分布與表達(dá)，為腺病毒介導(dǎo)BNP治療慢性心力衰竭奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 RT-PCR法從人心肌組織獲得hBNP片段，應(yīng)用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建Ad-hBNP;CHF成模大鼠24只，隨機(jī)分為4組，18只單次腹腔注射Ad-hBNP后，均分為1、4和7 d組;余不予Ad-hBNP，為0點(diǎn)組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)間處死，ELISA檢測(cè)血清hBNP水平，免疫組化檢測(cè)各臟器hBNP表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)各組織hBNPmRNA表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建用于實(shí)驗(yàn)性基因治療的Ad-hBNP，純化后滴度達(dá)到4.4×1012VP/mL。透射電鏡觀察Ad-hBNP呈多面體結(jié)構(gòu)，顆粒直徑在90 nm左右。單次腹腔注射Ad-hBNP，CHF大鼠心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟及小腸均檢測(cè)到hBNP表達(dá)，外源hBNP在CHF大鼠體內(nèi)的表達(dá)至少可持續(xù)7天。結(jié)論 腺病毒介導(dǎo)的外源hBNP基因可在CHF大鼠多臟器中得到有效表達(dá)，其生物學(xué)效應(yīng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于BNP的生物半衰期。

B型利鈉肽;腺病毒;慢性心力衰竭;基因治療

*通信作者（corresponding author）:yongminmao@163.com

B型利鈉肽 （B-type natriuretic peptide，BNP）是由左室肌細(xì)胞合成和分泌的一種肽類激素，其主要生理作用是:排尿利鈉，參與水鹽代謝;擴(kuò)張血管，降低周圍血管阻力;抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng);降低交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性;抗內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞的有絲分裂，并抑制其增殖等［1］。慢性心力衰竭 （Chronic heart failure，CHF）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，是多種心臟結(jié)構(gòu)或功能疾病損傷心室充盈和 （或）射血能力的結(jié)果。近年CHF發(fā)病率不斷增加，傳統(tǒng)藥物治療效果欠佳。BNP的生物學(xué)作用滿足了作為治療心力衰竭藥物的多項(xiàng)要求，已開始嘗試應(yīng)用于急性心力衰竭的治療，但BNP的半衰期短暫，難達(dá)到穩(wěn)定的治療效果，探尋可以使BNP在體內(nèi)持續(xù)存在的方法，對(duì)CHF的治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在構(gòu)建Ad-hBNP，觀察其在CHF大鼠體內(nèi)的分布與表達(dá)，為腺病毒介導(dǎo)的hBNP治療CHF奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pUCm-T載體（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司）;AdEasy缺陷性腺病毒載體系統(tǒng):穿梭質(zhì)粒pAd-Track-CMV，骨架質(zhì)粒pAdEasy-1（北京大學(xué)第一醫(yī)院研究所）;E.coilBJ5183、E.coilDH5α（天津心血管病研究所）;HEK 293T細(xì)胞（ATCC公司）;限制性內(nèi)切酶:KpnⅠ、SalⅠ、PmeⅠ、BamHⅠ和PacⅠ（MBI公司），高純度質(zhì)粒中量提取試劑盒［QIAGEN Plasmid Midi Kit（25）］、LipofectamineTMLTX 和plus Reagent（Invitrogen公司）;hBNP ELISA試劑盒（Adlitteram Diagnostic Laboratories，Lot No:RT110371）;免疫組織化學(xué)試劑:第一抗體鼠抗人BNP單克隆抗體（Santa Cruz Lot No:sc-101420），第二抗體 PV-9002（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;RNA提取試劑盒 RNAisoTM Plus［寶生物工程（大連）有限公司Cat No:D9108］。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒Ad-hBNP的構(gòu)建:RT-PCR方法從人心肌組織提取的RNA中獲得hBNP擴(kuò)增片段，與pUCm-T載體連接構(gòu)建pUC-hBNP重組質(zhì)粒;KpnⅠ和SalⅠ分別雙酶切 pUC-hBNP和pAd-Track-CMV，將目的片段插入pAd-Track-CMV相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hBNP;pAdTrack-CMV-hBNP經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒的E.coilBJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，同源重組獲得重組質(zhì)粒 pAdEasy-hBNP;經(jīng)BamHⅠ、PacⅠ酶切鑒定及基因序列檢測(cè)后，重組成功的pAdEasy-hBNP經(jīng)陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，經(jīng)過包裝、擴(kuò)增和CsCl密度梯度超速離心法純化后，A260法測(cè)定病毒滴度，電鏡檢測(cè)病毒形態(tài)。

1.2.2 構(gòu)建CHF大鼠模型:清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量250～300 g［中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK-（軍）2007-004］。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）、假手術(shù)組（n=10）及腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)組（n=40）。術(shù)后予以肌肉注射青霉素4×107U，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。術(shù)后12周通過超聲心動(dòng)圖測(cè)定左室舒張末徑（left ventrieular end diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù) （left ventrieular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventrieular fractional shortening，LVFS）證明慢性心力衰竭造模成功，確定CHF入選標(biāo)準(zhǔn)，獲得CHF成模大鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥方式:篩選CHF成模大鼠24只，隨機(jī)均分為4組，每組6只，其中18只單次腹腔注射2.5×1010VP/mL NS重組腺病毒Ad-hBNP 1 mL，為 1（D1）、4（D4）和7 d組（D7）;另 6 只CHF大鼠不予以重組腺病毒，記為0點(diǎn)組（D0）。

1.2.4 CHF大鼠血清 hBNP水平檢測(cè):采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清hBNP水平。具體步驟參照hBNP ELISA試劑盒說明書。

1.2.5 CHF大鼠多臟器hBNP表達(dá)測(cè)定:免疫組化染色檢測(cè)各組CHF大鼠心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及小腸hBNP的表達(dá)。標(biāo)本常規(guī)固定、包埋、切片，免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照所購抗體說明書操作，第一抗體稀釋度1∶50，DAB法顯色。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)CHF大鼠各臟器hBNPmRNA的表達(dá):采用Trizol法提取各組CHF大鼠心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及小腸各臟器總 RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得各臟器cDNA。hBNPmRNA引物:上游5'-CTGCGGCCGCATGGATCCCCAGAC-3'，下游 5'-C TGCAGCCAGATCTTCCTCTTAATGCCG-3'。PCR擴(kuò)增條件:95℃，預(yù)變性5 min;95℃，變性30 s;50℃，退火30 s;72℃，延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃，延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒Ad-hBNP的構(gòu)建

Ad-hBNP滴度為4.4×1012V P/mL。電鏡下Ad-hBNP顆粒呈多面體結(jié)構(gòu)，顆粒直徑為80～90 nm左右（圖1）。

圖1 Ad-hBNP電鏡圖Fig 1 The electron micrograph of Ad-hBNP

2.2 建立CHF大鼠模型

與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD及LVESD均增大，LVEF及LVFS均降低（P＜0.05，P＜0.01）（表1）?？梢姴捎酶怪鲃?dòng)脈縮窄術(shù)法能夠建立CHF大鼠模型。為確保下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的可靠性，制定CHF大鼠的入選標(biāo)準(zhǔn):LVESD ＞3.20 mm，LVEDD＞6.50 mm，LVEF＜75%，LVFS＜40%。篩選CHF大鼠24只，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CHF大鼠血清hBNP隨時(shí)間的變化

給藥后第1天，hBNP水平明顯增高，持續(xù)至第4天達(dá)頂峰，第7天回落（P＜0.01）（圖2）。

圖2 CHF大鼠血清hBNP隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig 2 hBNP serum levels of CHF rats in each group

2.4 CHF大鼠各臟器hBNP免疫組化檢測(cè)

D1、D4、D7組 CHF大鼠心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及小腸組織切片免疫組化染色均顯示有hBNP表達(dá)。hBNP在CHF大鼠的肺臟、脾臟表達(dá)量最高。心臟以血管（內(nèi)皮、平滑?。┟黠@，部分心室肌纖維淡染，間質(zhì)及外膜未著色。肝臟以血管內(nèi)皮染色明顯。腎臟染色主要集中于腎小體，其余部位不明顯。小腸上皮細(xì)胞著色明顯（圖3）。

2.5 CHF大鼠各臟器hBNP mRNA的表達(dá)

D1、D4、D7 組，CHF 大鼠心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及小腸均可擴(kuò)增出hBNP特異條帶，大小為434 bp，D0組未見hBNP特異條帶（圖4）。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)Table 1 The echocardiographic parameters from each group（±s）

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)Table 1 The echocardiographic parameters from each group（±s）

＊P＜0.01 compared with concrol group;△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with sham group.

LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）concrol 5.27±0.90 2.77±0.69 84.20±5.95 48.18±6.50 sham 5.94±0.67 3.28±0.42 82.90±3.32 46.52±3.89 CHF 7.45±1.05＊△△ 4.50±1.32＊△ 69.41±6.71＊△△ 34.81±4.96＊△△

3 討論

BNP主要由左室肌細(xì)胞合成分泌［2］，其主要生理作用包括:排鈉利尿，參與水鹽代謝調(diào)節(jié);擴(kuò)張血管，減輕心臟前負(fù)荷，降低體、肺循環(huán)阻力，增加心輸出量;抑制中樞和外周交感神經(jīng);抑制RAAS［3］。此外，BNP還對(duì)心肌細(xì)胞有直接的脂肪分解作用，拮抗血管組織的增生和纖維化［4］，對(duì)抑制心肌細(xì)胞肥大、防止心室重構(gòu)也發(fā)揮一定的作用［5］。

BNP獨(dú)特的生物學(xué)作用，滿足了作為治療心力衰竭藥物的多項(xiàng)要求，至今已有多項(xiàng)大規(guī)模臨床研究，如:VMAC，F(xiàn)U-SION 等［6-7］，表明 rhBNP 在改善急性失代償性充血性心力衰竭患者的臨床癥狀及血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面優(yōu)于或等同于傳統(tǒng)血管活性藥物，且耐受性更好，然而由于BNP半衰期短暫，僅有20 min，相對(duì)限制了其應(yīng)用，對(duì)于CHF的治療作用更是尚無定論?；蛑委煹某霈F(xiàn)，為BNP治療心力衰竭提供了新途徑。本實(shí)驗(yàn)選用腺病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建Ad-hBNP，利用其免疫原性低，可感染分裂和非分裂期細(xì)胞，不整合至宿主細(xì)胞基因組，無致突變等優(yōu)點(diǎn)，將外源性hBNP基因?qū)?CHF大鼠;由于BNP為循環(huán)作用激素，其靶器官分布廣泛，因此選用腹腔注射全身給藥的方式，觀察外源hBNP在CHF大鼠體內(nèi)的分布與表達(dá)。

研究結(jié)果表明，腹腔注射Ad-hBNP 24 h后CHF大鼠血清內(nèi)即檢測(cè)到hBNP，體現(xiàn)了腺病毒作為基因治療載體系統(tǒng)表達(dá)外源基因效率高的特點(diǎn)。外源hBNP在CHF大鼠體內(nèi)表達(dá)第4天達(dá)高峰，第7天與第1天水平相近，可見外源性hBNP表達(dá)至少可以持續(xù)7 d，彌補(bǔ)了BNP半衰期極短的缺陷，顯著提高血藥濃度維持時(shí)間，使其治療CHF成為可能。此外，還觀察了hBNP在CHF大鼠體內(nèi)的分布，與文獻(xiàn)報(bào)道腺病毒受體（CRA）在大鼠體內(nèi)的分布范圍基本一致。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hBNP于CHF大鼠脾臟內(nèi)特異染色顯著。Ad-hVEFG165在骨髓移植小鼠體內(nèi)的分布與表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)重組腺病毒于脾臟有較強(qiáng)的表達(dá)，并呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)［8］。目前該結(jié)果尚無合理解釋，機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)為BNP治療CHF提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但目前腺病毒載體仍面臨難于大規(guī)模生產(chǎn)、病毒污染、引起宿主免疫反應(yīng)等諸多問題，需要進(jìn)一步探索，繼續(xù)尋找理想的基因治療載體。

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Construction of recombinant adenovirus Ad-hBNP and its distribution/expression in CHF rats

SONG Yan-qiu1，ZHAO Li-li1，MAO Yong-min1*，ZHAO Hong-ming1，XU Mei-lin2，CUI Rang-zhuang1

（1.Tianjin Institue of Cardiovascular Disease;2.Pathology，Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300050，China）

ObjectiveTo construct Ad-hBNP and to observe the distribution/expression ofhBNPgene in CHF rats.MethodsThe target genehBNPwas obstained by reverse transcription polymerase chain reaction from human heart.The pAd-hBNP was constructed through AdEasy system.Recombinant plasmid pAd-hBNP was packaged and amplified in 293T cells.Ad-hBNP used in gene therapy was prepared.Twenty-four CHF rats were randomly divided into 4 groups for detecting the serum levels of hBNP with ELISA，the expression ofhBNPwith RT-PCR and immunohistochemistry in different groups.ResultsAd-hBNP was successfully constructed and the titer of purified Ad-hBNP was 4.4×1012VP/mL.Recombinant adenoviruses were shown as polyhedron shape under electron microscopy.The expression ofhBNPgene was detected in CHF rats by intraperitoneal injection Ad-hBNP and it continued at least 7 days.ConclusionsAd-hBNP is successfully constructed by using AdEasy system.Exogenous hBNP is effectively expressed in CHF rats.Compared with the half life of BNP，the biological process is significantly extended.

B-type natriuretic peptide;adnovirus;chronic heart failure;gene therapy

R 541.61

A

1001-6325（2012）01-0031-05

2010-12-03

2011-06-08

天津市衛(wèi)生局項(xiàng)目（07KY01）