陳今朝，王劍鋒*，王慧超，譚永忠

(1.長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2東華理工大學(xué)生物系，江西 撫州 344000)

熱穩(wěn)定酸性β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

陳今朝1，王劍鋒2,*，王慧超1，譚永忠1

(1.長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2東華理工大學(xué)生物系，江西 撫州 344000)

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌絲體破碎液依次經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過(guò)濾等步驟處理，獲得電泳純的β-葡萄糖苷酶，SDS-PAGE顯示其分子質(zhì)量為125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最適pH值為3.0～4.0，最適溫度為70℃，表觀米氏常數(shù)(Km)值為2.35mmol/L，表觀kcat/Km值為2.99×104L/(mol·s)；水解京尼平苷、水楊苷的表觀kcat/Km值分別是1.26×104、1.37×104L/(mol·s)；水解活性受Mn2+的顯著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等離子的微弱抑制。該酶活性在pH2.0～8.3保持穩(wěn)定；酶在65℃時(shí)保溫60min，殘余酶活達(dá)到了85%，是一種熱穩(wěn)定酸性β-葡萄糖苷酶。

胞內(nèi)酶；乙醇沉淀；對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷；京尼平苷；β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21)是纖維素完全酶解糖化的限速酶種[1]；具有水解和糖基轉(zhuǎn)移活性，底物專(zhuān)一性較差，對(duì)多種糖苷類(lèi)物質(zhì)均有較強(qiáng)的催化活性[2]。因而，BGL在纖維素生物煉制和藥食資源開(kāi)發(fā)利用等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如用于低聚龍膽糖的生產(chǎn)[3]、紅景天苷等糖苷類(lèi)活性物質(zhì)的酶法合成[4-5]和轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物中的糖苷類(lèi)物質(zhì)[6]，從而改善和提高果蔬茶的風(fēng)味及中草藥的藥理活性。黑曲霉是常見(jiàn)的BGL產(chǎn)酶菌種，也是食藥生產(chǎn)領(lǐng)域公認(rèn)的安全菌株。本實(shí)驗(yàn)室從霉?fàn)€的梔子果上分離到一株能水解京尼平苷的黑曲霉菌株Aspergillus niger L.，該菌株具有較強(qiáng)的耐酸性，在培養(yǎng)基初始pH1.5時(shí)，仍能正常產(chǎn)酶；該菌株可以產(chǎn)生兩種胞外酸性BGL，它們的最適反應(yīng)pH值均為2.5，其他酶學(xué)性質(zhì)也顯著區(qū)別于他種菌株來(lái)源的BGL[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Aspergillus niger L. 菌絲進(jìn)行了破碎抽提，從中制備了一種電泳純的BGL，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用Aspergillus niger L.源BGL提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑曲霉Aspergillus niger L.為實(shí)驗(yàn)室分離自霉變梔子果。

DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100 美國(guó)Pharmacia公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、聚乙二醇20000(PEG-20000)、對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、3,5-二硝基水楊酸(DNS) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

UV-1600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；QT-2H自動(dòng)液相色譜分離層析儀(配有N2000色譜數(shù)據(jù)工作站) 上海琪特分析儀器有限公司；DYCZ-3 型電泳槽、DYY-4C 型電泳儀 北京六一儀器廠；GL-21MC立式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JYD-900超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 上海之信儀器有限公司。

1.2 BGL的制備與分離

1.2.1 BGL的制備

Aspergillus niger L.孢子接種在豆渣培養(yǎng)基中28℃、180r/min培養(yǎng)5d；發(fā)酵醪液經(jīng)絲網(wǎng)過(guò)濾收集菌絲體，菌絲體用蒸餾水洗滌多次并壓干水分，然后將菌絲體分散在適量pH8.0、100mmol/L Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行超聲破碎，超聲功率800W、時(shí)間20min、破碎3s、暫停3s，后將菌絲破碎液于12000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 BGL的分離

取一定體積冷藏粗酶液，加入1.25倍體積-20℃乙醇混勻，冷凍離心得沉淀；沉淀以少量pH7.5、20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解，上柱DEAE-Sepharose FF、洗柱至基線平直，用同樣緩沖液配制的0～0.4mol/L NaCl溶液400mL線性梯度洗脫，洗脫流速90mL/h，每5.0mL收集一管，檢測(cè)與280nm波長(zhǎng)處光吸收峰相對(duì)應(yīng)各管的酶活力和純度。收集各管酶液于透析袋中并用PEG-20000包埋濃縮；濃縮酶液進(jìn)行凝膠過(guò)濾Sephadex G-100，pH7.5、20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速10mL/h，每3.0mL收集一管，檢測(cè)蛋白峰各管酶活力。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

依據(jù)Bradford法[8]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 SDS-PAGE[9]

SDS-PAGE條件：濃縮膠4%、分離膠10%，染色劑：考馬斯亮藍(lán)R-250。

1.3.3 BGL活性的測(cè)定[7]

采用pNPG法和DNS法分別測(cè)定BGL的活性。

1.3.4 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在不同溫度下pNPG法測(cè)定酶活力，以酶活力最高時(shí)的反應(yīng)溫度為最適反應(yīng)溫度；酶液在不同溫度下分別水浴保溫20、40、60min后測(cè)定酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%，比較不同溫度條件下的相對(duì)酶活力。

1.3.5 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

在不同pH值的緩沖液中按照pNPG法測(cè)定酶活力，以酶活最高時(shí)的反應(yīng)pH值為最適反應(yīng)pH值；將酶液用不同pH值的緩沖液同等倍數(shù)稀釋?zhuān)?5℃水浴保溫12h，測(cè)定相對(duì)酶活力。

1.3.6 無(wú)機(jī)離子對(duì)酶活力的影響

在含待考察離子10mmol/L的酶促反應(yīng)體系中以pNPG為底物測(cè)定酶活力，以去離子水透析的酶液的酶活力為100%。

1.3.7 酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

在65℃、pH4.0、100mmol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液中酶液與不同濃度底物反應(yīng)，用Linewear-Burk作圖法求出酶水解底物的米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速率(Vmax)，測(cè)定酶蛋白量計(jì)算酶的底物轉(zhuǎn)換數(shù)(kcat)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件DPS v3.01專(zhuān)業(yè)版，SSR檢驗(yàn)顯著性水平α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Aspergillus niger L.胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的分離與純化

圖1 β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of BGL from Aspergillus niger L.

菌絲體經(jīng)超聲破碎抽提獲得BGL75.2U/g(以菌絲干質(zhì)量計(jì))。粗酶液分別用PEG-6000(20mg/100mL)、(NH4)2SO490%飽和度沉淀濃縮，酶活回收率分別為14%和81%，顯示胞內(nèi)BGL與胞外BGL在溶解性上存在顯著差異。粗酶液依次經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、D EA E-Seph arose FF、Sephadex G-100柱層析(表1)，獲得了電泳純的BGL，SDS-PAGE圖譜(圖1)顯示BGL的分子質(zhì)量為125.7kD。

表1 β-葡萄糖苷酶的分離純化Table 1 Purification of BGL from Aspergillus niger L.

2.2 Aspergillus niger L.胞內(nèi)BGL的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 pH值對(duì)BGL活性及穩(wěn)定性的影響

圖2 pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on BGL activity

由圖2可知，在pH值2.0～6.5的范圍內(nèi)，BGL對(duì)pNPG均有明顯的水解活性，其中pH值為3.0～4.0時(shí)，酶的水解活性最高；此外，酶的水解活性隨pH值變化而下降，pH值由3.0下降至2.0時(shí)，酶活下降了66%，而pH值由4.0上升至5.0時(shí)，酶活下降了30%，說(shuō)明在較低的pH值范圍內(nèi)，酶活力對(duì)酸度的變化更明顯。25℃保溫12h后，BGL殘余酶活力在pH2.0～8.3的范圍內(nèi)穩(wěn)定，說(shuō)明胞內(nèi)BGL具有很好的pH值穩(wěn)定性。

2.2.2 溫度對(duì)BGL活性及穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on BGL activity

圖4 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Combined effects of temperature and incubation time on BGL stability

表2 金屬離子對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Table 2 Effects of inorganic ions on BGL activity as tested using pNPG as substrate

由圖3可知，BGL在30～80℃均有水解活性，最適作用溫度為70℃，但反應(yīng)溫度高于70℃時(shí)，相對(duì)酶活力急劇下降，80℃時(shí)的反應(yīng)活性與30℃時(shí)的活性相當(dāng)。由圖4可知，在65℃保溫60min，相對(duì)酶活力為85%，而在70℃保溫60min，相對(duì)酶活力僅為14%，因此，胞內(nèi)BGL有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 金屬離子對(duì)BGL活性的影響

由表2可知，BGL水解pNPG的活性受不同金屬離子(10mmol/L)的影響。Mn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+、Na+、Hg+等離子激活BGL水解活性，其中以Mn2+的作用最為顯著；Cu2+、Zn2+、Fe2+等抑制酶活性，F(xiàn)e2+的抑制作用較明顯；K+和Ca2+對(duì)酶活性則無(wú)明顯影響。

2.2.4 BGL的底物特異性及催化效率

在pH4.0、65℃的反應(yīng)條件下，依據(jù)Linewear-Burk作圖法分別以pNPG、京尼平苷、水楊苷為底物測(cè)定BGL的Km、kcat(表3)。依專(zhuān)一性常數(shù)kcat/Km可知，胞內(nèi)BGL水解pNPG的催化效率是京尼平苷、水楊苷的兩倍多，而水解后兩者的催化效率相當(dāng)，因此，pNPG是胞內(nèi)BGL的最適底物；同時(shí)也說(shuō)明BGL對(duì)β-葡萄糖苷的苷元物質(zhì)具有選擇性。

表3 β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Km and kcat values of BGL for three specific substrates

3 討 論

微生物源BGL的分子質(zhì)量、酶學(xué)性質(zhì)因菌種、菌株不同而有較大差異，其適用范圍也隨之不同。BGL的分子質(zhì)量一般介于40～250kD，多數(shù)在70～138kD；最適反應(yīng)pH值為3.5～7.0，以pH4.0～6.0常見(jiàn)；pH值穩(wěn)定范圍多在pH4.0～8.0；最適反應(yīng)溫度常為55℃，部分為65～70℃；熱穩(wěn)定范圍常小于60℃[1,10-22]。Aspergillus niger L.株胞內(nèi)BGL的分子質(zhì)量為125.7kD，最適反應(yīng)溫度、pH值分別為70℃、3.0～4.0，pH值穩(wěn)定范圍為pH2.0～8.3，65℃保溫60min，相對(duì)酶活力保留85%，除分子質(zhì)量與Aspergillus niger NL-1胞內(nèi)BGL(122.7kD)[14]接近外，最適反應(yīng)溫度、pH值、pH值穩(wěn)定范圍和熱穩(wěn)定溫度均明顯不同于后者(60℃、5.0、3.0～6.0、60℃)，也區(qū)別于實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)生的胞外BGL(55℃、2.5、2.0～7.0，55～60℃)[7]；因此，該酶是一種耐酸耐熱的BGL，它的分子質(zhì)量和最適反應(yīng)pH值與Penicillium pinophilum[11]Penicillium purpurogenum[16]等來(lái)源的BGL相近，最適反應(yīng)溫度與Penicillium decumbens[1]、 Penicillium citrinum[19]、Periconia sp.[20]、Fomitopsis palustris[22]等來(lái)源的BGL相同，熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于Termitomyces clypeatus來(lái)源的BGL(60℃保溫1h，殘余酶活80%)[13]，而不及Periconia sp.來(lái)源的BGL(70℃保溫1.5h，殘余酶活60%)[20]。

BGL的水解專(zhuān)一性較差，能作用于所有的葡萄糖β-二聚物；作用于β-1,4、β-1,1、β-1,2、β-1,3和β-1,6連鍵；裂解C-O糖苷鍵、C-S鍵、C-N鍵和C-F鍵等；有些能水解β-葡萄糖苷、β-半乳糖苷，甚至木糖苷[2]。實(shí)驗(yàn)菌株胞內(nèi)BGL對(duì)鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷無(wú)水解活性，區(qū)別于其胞外BGL，說(shuō)明該酶底物專(zhuān)一性高于胞外BGL，對(duì)底物的糖苷鍵構(gòu)型和糖基種類(lèi)均具有選擇性。底物專(zhuān)一性常數(shù)kcat/Km顯示，該BGL對(duì)pNPG、水楊苷和京尼平苷等β-D-吡喃葡萄糖苷均有催化活性，pNPG是其天然底物，水解京尼平苷和水楊苷的催化效率相當(dāng)且遠(yuǎn)低于pNPG，表明胞內(nèi)BGL的催化效率受底物分子中苷元結(jié)構(gòu)的影響，而胞外兩種BGL的天然底物是京尼平苷，其對(duì)京尼平苷的催化效率(kcat/Km分別為4.28×104L/(mol·s)和1.04×105L/(mol·s))[7]也遠(yuǎn)高于胞內(nèi)BGL；并且胞內(nèi)BGL對(duì)pNPG的催化效率高于未培養(yǎng)源BGL1T[12]和源于Penicillium citrinum的嗜酸熱BGL[19]。胞內(nèi)BGL的催化活性也受金屬離子的明顯影響，受Mn2+的顯著激活，受Fe2+、Zn2+、Cu2+等的抑制，但受抑制強(qiáng)度顯著弱于胞外BGL1。

Aspergillus niger L. 菌株胞內(nèi)BGL具有耐酸耐熱、專(zhuān)一性較強(qiáng)、催化活性高且受金屬離子影響小等特點(diǎn)，其酶學(xué)性質(zhì)顯著優(yōu)于他種來(lái)源的β-葡萄糖苷酶，適用于橙汁脫苦、中草藥活性成分轉(zhuǎn)化、纖維素酶解糖化等酸性高溫的工業(yè)應(yīng)用環(huán)境。

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Purification and Characterization of Thermostable Acidic β-Glucosidase from Aspergillus niger L.

CHEN Jin-zhao1，WANG Jian-feng2,*，WANG Hui-chao1，TAN Yong-zhong1
(1. Life Science and Technology Institute, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China ；2. Department of Biology, East China Institute of Technology, Fuzhou 344000, China)

In this study, an acidic β-glucosidase (BGL) was purified from acid-tolerant Aspergillus niger L. mycelia by ethanol precipitation, DEAE-Sepharose column chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. SDS-PAGE showed that the molecular weight of the enzyme was 125.7 kD. Further characterization revealed that it had maximal hydrolytic activity on p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) at pH 3.0 — 4.0 and 70 ℃ with a Kmof 2.35 mmol/L and a kcat/Kmof 2.99 × 104mol/L·s. The kcat/Km values for hydrolyzing geniposide and salicin were 1.26 × 104L/(mol·s) and 1.37 × 104L/(mol·s), respectively. The hydrolytic activity was activated obviously by Mn2+but inhibited faintly by Fe2+, Zn2+and Cu2+. The BGL was highly stable at pH 2.0 — 8.5, and 85% of its original activity could be maintained after 60 min of heat treatment at 65 ℃. Thus, the enzyme was highly stable to heat.

intracellular enzyme；ethanol precipitation；p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside；genipin；βglucosidase

Q939.97

A

1002-6630(2012)11-0205-05

2011-06-03

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(CSTC，2011AC1004)

陳今朝(1964—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ?。E-mail：chenjinzhao@126.com

*通信作者：王劍鋒(1968—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ?。E-mail：wangjianfeng68@126.com